Helsingin yliopisto

 

Helsingin yliopiston verkkojulkaisut

University of Helsinki, Helsinki 2006

Enzymes with radical tendencies: the PFL family

Lari Lehtiö

Doctoral dissertation, November 2006.
University of Helsinki, Faculty of Biosciences, Department of Biological and Environmental Sciences and Research Program in Structural Biology and Biophysics, Institute of Biotechnology, University of Helsinki and National Graduate School in Informational and Structural Biology.

Glysyyliradikaalientsyymit (GRE:t) muodostavat proteiiniperheen, jonka jäsenet aktivoiduttuaan varastoivat radikaalin glysiini aminohappoon. GRE:t toimivat ainoastaan anaerobisissa eli hapettomissa olosuhteissa. Jos nämä entsyymit altistuvat hapelle, niiden aminohappoketju katkeaa ja entsyymi inaktivoituu. Eniten tutkitut GRE:t, anaerobinen ribonukleotidireduktaasi (RNRIII) ja pyruvaattiformaattilyaasi (PFL), ovat tietyille hapettomissa oloissa eläville organismeille välttämättömiä entsyymejä. RNRIII katalysoi reaktiota jota tarvitaan DNA:n valmistukseen. PFL puolestaan toimii mikrobin anaerobisessa energiantuotannossa. Sekä RNRIII:n että PFL:n rakenteet on ratkaistu ja ne muistuttavat toisiaan, vaikka niiden aminohappojärjestys on hyvin erilainen.

Väitöskirjatyössäni olen tutkinut GRE:ejä röntgensädekristallografian ja bioinformatiikan menetelmin. PFL:n katalysoimassa reaktiossa pyruvaatin hiiliatomien välinen sidos katkeaa ja syntyy lopulta formaattia ja asetyylikoentsyymi A:ta. PFL:n kiderakenne yhdessä pyruvaatin kanssa paljasti, että pyruvaatti sitoutuu aktiiviseen keskukseen hyvin samalla tavalla kuin sen analogi oksamaatti. Oksamaatti on kuitenkin inertti, eikä toimi entsyymin varsinaisena substraattina eikä inhibiittorina. Onkin todennäköistä, että entsyymin aktivoiduttua eli radikaalin muodostumisen jälkeen, aktiivisen keskuksen konformaatio on muuttunut. Olisi tärkeää selvittää aktivoidun entsyymin kiderakenne, jotta rakenteen perusteella voitaisiin tehdä johtopäätöksiä entsyymin toimintamekanismista.

Viime vuosien aikana tieto eri organismien perimästä on kasvanut valtavasti ja sen johdosta on löydetty uusia, emässekvenssin perusteella GRE:n kaltaisia geenejä. Väitöskirjatyössä vertailtiin tietokannoista löytyvien GRE:n kaltaisten entsyymien aminohappojärjestyksiä, ryhmiteltiin ne samankaltaisiin joukkoihin ja pyrittiin löytämään vakioisia alueita eri joukkojen sisältä sekä niiden väliltä. Saatua tietoa verrattiin aiemmin ratkaistuun PFL:n kiderakenteeseen. Vakioisten alueiden perusteella ehdotettiin mm. entsyymin aktivointireittiä, jonka kautta GRE:ä aktivoiva entsyymi pystyisi luomaan glysyyliradikaalin. Tietokannoista löytyvistä sekvensseistä löydettiin myös uusi aiemmin tunnistamaton GRE ryhmä, jonka jäsenet ovat merkittävästi pienempiä kuin aiemmin tunnetut entsyymit.

Yksi tuntematon entsyymi, arkkibakteerin PFL2, valittiin tarkemman tutkimuksen kohteeksi, koska kyseinen arkkibakteeri, Archaeoglobus fulgidus, elää hyvin korkeissa lämpötiloissa, parhaiten 83 asteessa. A. fulgiduksen epätavallinen kasvulämpötila asettaa erityisvaatimuksia myös sen proteiineille, sillä näin korkeassa lämpötilassa proteiinit yleensä denaturoituvat. Korkean lämpökestävyyden takia PFL2 entsyymin glysyyliradikaalin voidaan olettaa olevan huoneenlämmössä stabiilimpi kuin PFL:n vastaava. Tämä saattaa mahdollistaa aktiivisen entsyymin rakenteen tutkimisen. Yhdistelmä-DNA-tekniikan avulla A. fulgiduksesta monistettiin PFL2:ta koodaava geeni ja tuotettiin entsyymiä Escherichia coli-bakteerissa. Proteiini puhdistettiin, kiteytettiin ja sen rakenne ratkaistiin röntgensädekristallografian avulla. PFL2:n rakenne muistuttaa hyvin paljon yllä mainitun PFL:n rakennetta, mutta se on kuitenkin hieman lähempänä toisen GRE:n, hiljattain löydetyn glyseroli dehydrataasin (GD), rakennetta. PFL2:n kiderakenteessa aktiiviseen keskukseen on sitoutuneena pienmolekyyli, jonka elektronitiheys vastaa glyserolia. PFL2:n ja GD:n kiderakenteiden perusteella vaikuttaisi, että PFL2 olisi myös dehydrataasi, jonka substraatti on glyserolin kaltainen - ehkä hieman suurempi. Muista GRE:istä poiketen PFL2 on tetrameeri, joka koostuu kahden sijaan neljästä samanlaisesta alayksiköstä. Tällä on merkitystä entsyymin säätelyn kannalta, sillä yleensä ainoastaan toinen GRE:n alayksiköistä on aktiivinen. PFL2:n rakenteesta löytyi useita tekijöitä, jotka mahdollistavat entsyymin korkean lämpökestävyyden: mm. parempi aminohappojen pakkautuminen, suurempi määrä varauspareja, lyhyemmät silmukat ja niiden ankkurointi sekä ehkä myös suurempi alayksikköjen määrä.

Avainsanat: glysyyliradikaali, entsyymi, pyruvaattiformaattilyaasi, röntgensädekristallografia, bioinformatiikka

Julkaisun nimiösivu

This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.

© University of Helsinki 2006

Last updated 31.10.2006

Yhteystiedot, Contact information E-thesis Helsingin yliopisto, University of Helsinki