Helsingin yliopisto

 

Helsingin yliopiston verkkojulkaisut

University of Helsinki, Helsinki 2006

Characterization of the molecular components and function of BARE-1, Hin-Mu and Mu transposition machineries

Anna-Helena Saariaho

Doctoral dissertation, June 2006.
University of Helsinki, Faculty of Biosciences, Department of Biological and Environmental Sciences, Division of Genetics and Institute of Biotechnology.

Kaikkien eliöiden perimä koostuu geeneistä jotka ohjeistavat elintärkeitä toimintoja, sekä ns. toistuvista DNA-jaksoista joiden osuus perimästä vaihtelee, ollen bakteereilla n. 3%, ihmisellä 45% ja joillain kasveilla jopa yli 70%. Näitä toistojaksoja pidettiin aikoinaan turhana "roska DNA:na" koska niiden toiminnasta ei ollut tietoa. Liikkuvat geneettiset elementit, "hyppivät geenit" eli transposonit ovat osa tätä toistuvaa DNA:ta. Tänä päivänä tiedetään että näillä elementeillä on tärkeä merkitys perimän evoluutiossa, ja jopa geenien synnyssä. Esimerkiksi nisäkkäiden immuunipuolustuksen vasta-ainegeenien uudelleenjärjestelymekanismin ajatellaan kehittyneen transposonisysteemistä. Bakteereilla antibioottien vastustuskykyä koodaavat geenit siirtyvät usein solusta toiseen transposonien välityksellä. Myös eräät virukset kuten HIV-1 ja bakteerivirus Mu toimivat kuten transposonit.

Huolimatta transposonien monimuotoisuudesta ne kaikki käyttävät hyvin samanlaista liikkumismekanismia, transpositiota. Transposonit kokoavat transpositiokoneiston jossa yksinkertaisimmillaan transposaasi proteiinit ovat sitoutuneet transposoni DNA:n päihin muodostaen DNA-proteiinikompleksin (ydinkoneiston). Tässä kompleksissa transposaasi katalysoi kemialliset reaktiot, DNA:n katkaisun ja uudelleen liittämisen, ja tämän koneiston avulla transposoni liikkuu paikasta toiseen. Se kuinka nämä koneistot kootaan ja kuinka ne molekyylitasolla toimivat määrittää monia ominaisuuksia transposonin elinkierrossa. Tässä työssä tutkittiin kolmen transposonin transpositiokoneistoja, tunnistettiin niiden molekulaariset (proteiini ja DNA) komponentit, sekä tutkittiin niiden ominaispiirteitä ja toiminnallisuutta.

Ensimmäisessä osassa tutkimme ohran retrotransposonia, BARE-1:a, jonka elämänkiertoon oletettavasti kuuluu RNA välivaihe ja viruksen kaltaiset partikkelit (VLP:t), jotka muistuttavat rakenteeltaan ja toiminnaltaan viruksia ja toimivat retrotransposonin transpositiokoneistona. Etsimme ohran solu-uutteista BARE-1:n VLP-koneiston komponentteja sekä koottuja VLP-koneistoja. Osoitimme että kaikki proteiini ja DNA komponentit jotka tarvitaan toiminnalliseen VLP-koneistoon voidaan havaita puhdistetuista ohran solu-uutteista. Elektronimikroskopian avulla havaitsimme myös rakenteita jotka muistuttavat viruksen kaltaisia partikkeleja. Työmme tulokset viittaavat siihen että BARE-1 voi olla aktiivinen retrotransposoni, joka kokoaa VLP-koneiston ja käyttää sitä liikkumiseen ohran perimässä.

Toinen ja kolmas osa tutkimuksesta käsittelee transpositiota hyväksikäyttäviä bakteeriviruksia. Bakteerivirus Mu voi infektoida useita bakteerilajeja ja liittyä transpositiolla bakteerin perimään pysyen siellä piilevänä lisääntymättä (provirus). Vaihtoehtoisesti se voi lisääntyä bakteerisolussa monistumalla transposition avulla, jolloin isäntäsolu kuolee ja satoja uusia viruksia vapautuu etsimään uutta isäntäsolua. Mu on toiminut transposonitutkimuksen mallina, ja sen transpositiokoneiston toiminta tunnetaan tarkkaan, sillä sen liikkumismekanismina on jo pitkään voitu tutkia tehokkaasti ja yksinkertaisesti koeputkiolosuhteissa. Toiminnallinen Mu:n transpositiokoneisto voidaan koota koeputkessa käyttämällä transposaasiproteiini MuA:ta ja Mu:n DNA:n päitä. Tämän ydinkoneiston toimintaa voidaan tutkia molekyylitasolla.

Muita Mu:n kaltaisia transposoniviruksia on tutkittu hyvin vähän. H. influenzae bakteerin perimässä on Mu-viruksen kaltainen DNA jakso, jonka nimesimme Hin-Mu profaagiksi. Tässä työssä määritimme Hin-Mu:n ydinkoneiston proteiini ja DNA komponentit, tuotimme ja puhdistimme ko. komponentteja ja tutkimme niiden ominaispiirteitä vertaamalla niitä Mu:n vastaaviin komponentteihin, ja osoitimme Hin-Mu:n ydinkoneiston olevan toiminnallinen vastaavissa koeputkiolosuhteissa joissa Mu:n transpositiota tutkitaan. Hin-Mu on ensimmäinen Mu:n kaltainen profaagi jonka transpositiokoneisto on tunnistettu ja osoitettu toiminnalliseksi. Työmme myös osoitti, että Mu:n ja Hin-Mu:n transpositiokoneistot ovat rakenteeltaan hyvin samankaltaisia, mutta omaavat tiettyjä toiminnallisia erilaisuuksia. Osoitimme myös että Mu transpositiokoneiston MuA transposaasi on hyvin joustava ja pystyy hyväksikäyttämään myös Hin-Mu:n transpositiokoneiston DNA komponentteja. Mu:n koneiston joustavuutta tutkittiin lisää käyttämällä ns. silmukkamuotoisia Mu DNA:n päitä (substraatteja), sillä tiedetään että osa transposoneista irrottautuu isäntänsä perimästä muodostamalla välituotteena ns. DNA:n silmukkarakenteen (hairpin). Tutkimme Mu:n koneiston kykyä käyttää hyväkseen tällaisia silmukkamuotoisia DNA substraatteja. Tutkimuksemme osoitti, että Mu:n transpositiokoneisto on niin joustava että se kykenee ottamaan erilaisia silmukkarakenteisia DNA substraatteja koneistona osaksi, avaamaan suljetut DNA silmukat, ja liittämään ne uuteen kohde DNA:han. Työ osoitti uudenlaista joustavuutta Mu:n transpositiokoneistolta ja MuA proteiinilta DNA substraattiin sitoutumisessa ja sen prosessoinnissa. Havaittu transpositiokoneiston joustavuus voi olla sekä evolutiivisesti että mekanistisesti tärkeää.

Julkaisun nimiösivu

This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.

© University of Helsinki 2006

Last updated 19.05.2006

Yhteystiedot, Contact information E-thesis Helsingin yliopisto, University of Helsinki