Helsingin yliopisto

 

Helsingin yliopiston verkkojulkaisut

University of Helsinki, Helsinki 2006

Characterisation, cloning and production of industrially interesting enzymes: gluconolactone oxidase of Penicillium cyaneo-fulvum and gluconate 5-dehydrogenase of Gluconobacter suboxydans

Tuomas Salusjärvi

Doctoral dissertation, May 2006.
University of Helsinki, Faculty of Biosciences, Department of Biological and Environmental Sciences, Division of Biochemistry.

Erytorbiinihappo on C-vitaminiinin stereoisomeeri, jota käytetään elintarvikkeissa antioksidanttina. Erytorbiinihappoa tuotetaan teollisuudessa moniportaisella prosessilla, joka on samankaltainen kuin C-vitamiinin valmistuksessa käytettävä Reichstein-prosessi. Luonnossa ainoastaan Penicillium-homeiden on havaittu tuottavan erytorbiinihappoa. Synteesireitti glukoosista erytorbiinihapoksi on lyhyt, sisältäen vain kaksi entsyymiä, glukoosioksidaasin, joka hapettaa glukoosin glukono-1,5-laktoniksi (joka vesiliuoksessa spontaanisti tasapainottuu glukono-1,4-laktonin ja glukonihapon kanssa) ja glukonolaktonioksidaasin, joka hapettaa glukono-1,5- ja glukono-1,4-laktonin edelleen erytorbiinihapoksi. 1960- ja 1970-luvuilla kehiteltiin menetelmiä erytorbiinihapon tuottamiseksi Penicillium-homeilla, mutta kannattavaa prosessia ei ole onnistuttu rakentamaan.

Tartarihappo on toinen elintarviketeollisuuden kannalta melko keskeinen orgaaninen happo, jota käytetään paitsi happamuuden säätelyaineena myös raaka-aineena emulgointiaineiden valmistuksessa. Tartarihappoa tuotetaan nykyisin pääasiassa viiniteollisuuden sivutuotteena. Koska viinintuotannon vuotuinen sadonvaihtelu heijastuu voimakkaasti myös tartarihapon markkinahintaan, uusia menetelmiä hapon tuottamiseksi on etsitty vakaamman hintatason takaamiseksi. Tartarihappoa voidaankin valmistaa 5-ketoglukonihaposta hapettamalla esimerkiksi jalometallien tai vanadaatin avulla. 5-ketoglukonihappoa voidaan valmistaa glukoosista fermentoimalla käyttäen 5-ketoglukonihappoa tuottavia Glukonobacter- tai Acetobacter-kantoja.

Tässä väitöstutkimuksessa on selvitetty mahdollisuuksia tuottaa erytorbiinihappoa, 5-ketoglukonihappoa ja tartarihappoa geneettisesti muokatuilla tuotantomikrobeilla. Työssä on tuotettu ja puhdistettu erytorbiinihapon ja 5-ketoglukonihapon synteesejä katalysoivat entsyymit glukonolaktonioksidaasi ja glukonaatti-5-dehydrogenaasi. Osittaisen aminohapposekvenssien avulla entsyymejä koodaavat geenit on kloonattu cDNA- ja genomikirjastoista. Kumpaakin entsyymiä on ylituotettu heterologisessa isäntämikrobissa (Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris). Rekombinanttisesti tuotettuja entsyymejä on karakterisoitu ja niiden sekä keinotekoisen metaboliareitin omaavien tuotantomikrobien soveltuvuutta kyseisten orgaanisten happojen teolliseen tuotantoprosessiin on arvioitu.

Sekä erytorbiinihappoa että 5-ketoglukonihappoa tuotettiin sekä rekombinanttisten entsyymien että geneettisesti modifioitujen tuotantoisäntien avulla. Glukonolaktonioksidaasia ylituotettiin 72-kertaisesti P. pastoriksessa verrattuna villityypin Penicillium cyaneo-fulvum-kantaan. Rekombinanttisesti tuotettu glukonolaktonioksidaasi immobilisoitiin ja immobilisoidulla entsyymillä onnistuttiin tuottamaan erytorbiinihappoa glukonihaposta. P. pastoris-kanta, jossa ylituotettiin sekä Aspergillus nigerin glukoosioksidaasia että glukonolaktonioksidaasia, konvertoi fermantaatiossa glukoosia erytorbiinihapoksi 6% saannolla. Tutkimusessa glukonolaktonioksidaasin havaittiin olevan erittyvä entsyymi, toisin kuin aiemmin on luultu ja se onkin toistaiseksi ainoa tunnettu erittyvä sokerilaktonioksidaasi. Geenisekvenssin perusteella havaitiin, että P. cyaneo-fulvumin glukonolaktonioksidaasi on ainoastaan kaukainen sukulainen muille tunnetuille sokerilaktonioksidaaseille muodostaen oman erittyvien laktonioksidaasien alaryhmän.

Glukonaatti-5-dehydrogenaasin ylituotto E. colissa osoittautui vaikeaksi ja rekombinanttista entsyymiä onnistuttiin tuottamaan ainoastaan lähes samalla tasolla kuin villityypin Gluconobacter suboxydansissa. Koska E. colissa ei kuitenkaan ole sivuaktiivisuutena glukonaatti-2-dehydrogenaasia, ovat 5-ketoglukonaatin maksimisaannot rekombinanttikannalla teoriassa parempia kuin G. oxydanssissa, jolla fermentoitaessa osa glukonihaposta päätyi 2-ketoglukonihapoksi. Geneettisesti modifioidulla E. colilla onnistuttiin konvertoimaan 75% glukonihaposta 5-ketoglukonihapoksi. Glukonaatti-5-dehydrogenaasin geenisekvekssin avulla löytyi kuitenkin mielenkiintoinen homologinen karakterisoimaton entsyymi Xanthomonas campestriksesta. Tämän entsyymin geenin kloonaus ja ylituotto onnistui selvästi paremmin ollen 25-kertainen villityyppiin verrattuna. Karakterisoitaessa entsyymi osoittautuikin glukonaatti-5-dehydrogenaasiksi eikä todennäköiseksi glukoosidehydrogenaasiksi, kuten se oli sekvensointiprojektin yhteydessä GenBank:iin nimetty. Kumpikin entsyymi osoittautui kuitenkin omaavan huomattavasti laajemman substraattispesifisyyden, pystyen käyttämään substraattinaan glukonihapon lisäksi monia erilaisia polyoleja, kuten sorbitoli ja arabitoli. Suurimmat aktiivisuudet mitattiin käyttäen substraattina 2,3-butandiolia. Entsyymien substraattispesifisyys vastaa hyvin empiirisiin havaintoihin perustuvaa Bertrand-Hudsonin sääntöä sekundääristen polyolien hapettamisesta etikkahappobakteereilla. Luultavasti glukonaatti-5-dehydrogenaasi vastaa pääosin tästä säännöstä. Laajasta substraattispesifisyydestä johtuen glukonaatti-5-dehydrogenaasin teolliset sovellutukset ovat paljon aiemmin oletettua laajemmat ja sille voi löytyä lisää sovelluksia mm. C-vitamiinin ja joidenkin hienokemikaalien teollisessa tuotannossa.

Julkaisun nimiösivu

This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.

© University of Helsinki 2006

Last updated 27.04.2006

Yhteystiedot, Contact information E-thesis Helsingin yliopisto, University of Helsinki