Helsingin yliopisto

 

Helsingin yliopiston verkkojulkaisut

University of Helsinki, Helsinki 2006

Structure and function of GDNF receptor alpha splice variants

Jianmin Yang

Doctoral dissertation, December 2006.
University of Helsinki, Faculty of Biosciences, Department of Biological and Environmental Sciences, Institute of Biotechnology, University of Helsinki.

GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) -perheen hermokasvutekijät GDNF, neurturiini (NRTN), artemiini (ARTN) ja persefiini (PSPN) osallistuvat useiden hermosolutyyppien kehittymiseen, erilaistumiseen ja ylläpitoon. Niillä on myös tärkeitä toimintoja hermoston ulkopuolella munuaisen, testiksen sekä kilpirauhasen kehityksessä. Kukin näistä GFL:istä (GDNF family ligand) sitoutuu ensisijaisesti yhteen glykosyylifosfatidyyli-inositoli (GPI) -ankkuroituun GFRα (GDNF family receptor α) -reseptoriin: GDNF sitoutuu GFRα1:een, NRTN GFRα2:een, ARTN GFRα3:een ja PSPN GFRα4:een. Jokainen GFL sitoutuu yhdessä siihen kuuluvan GFRα-reseptorin kanssa reseptorityrosiinikinaasi RET:iin ja signaloi sen kautta.

Hiiren GFRα4-geenin vaihtoehtoisen silmikoinnin tuloksena on oletettu syntyvän kolmenlaisia GFRα4-reseptoreja - GPI-ankkuroituja, solukalvon lävistäviä sekä liukoisia. Havaitsin ensin, että mahdollinen GPI-ankkuroitu GFRα4 (GFRα4-GPI) on glykosyloitu sekä todella sitoutunut solukalvoon GPI-ankkurilla ja interaktoi PSPN:n sekä RET:n kanssa. Osoitimme myös, että hiiren GFRα4-GPI välittää PSPN:n indusoimaa RET:n fosforylaatiota ja edistää PSPN:stä riippuvaa rotan feokromosytoomaperäisen PC6-3-solulinjan solujen erilaistumista neuronaalisiksi sekä CGN (cerebellar granule neuron) -solujen PSPN:stä riippuvaa eloonjäämistä. Vaikka tämä reseptori pystyy välittämään PSPN:n signalointia ja aktivoimaan RET:n, GFRα4-GPI ei kuitenkaan vedä RET:ä mukanaan solukalvon lipidilautoille. Tämän tapahtuman on aikaisemmin oletettu olevan ratkaisevassa asemassa GDNF- ja GFL-välitteisessä RET-signaloinnissa.

Seuraavaksi osoitin, että mahdollinen transmembraani-GFRα4 (GFRα4-TM) on todella solukalvon läpäisevä GFRα4-proteiini. Vaikka se sitoo heikosti PSPN:ä, se ei kuitenkaan pysty välittämään PSPN:stä riippuvaa RET:n fosforylaatiota, neuronaalista erilaistumista tai eloonjäämistä. Tämä aineisto osoittaa, että GFRα4-TM on PSPN-reseptorina inaktiivinen. Yllättäen GFRα4-TM pystyy kuitenkin säätelemään negatiivisesti PSPN:stä riippuvaa GFRα4-GPI:n kautta tapahtuvaa signalointia. GFRα4-TM interaktoi GFRα4-GPI:n kanssa ja estää PSPN:stä riippuvan RET-fosforylaation, neuronaalisen erilaistumisen sekä eloonjäämisen. Yhdessä tuloksemme osoittavat, että GFRα4-TM saattaa toimia dominant negative -tyyppisenä inhibiittorina PSPN-välitteiselle signaloinnille.

Mielenkiintoisin osa työstäni oli havainto, että mahdollinen liukoinen GFRα4 (GFRα4-sol) voi muodostaa homodimeerejä ja toimia RET-reseptorin agonistina. Ilman PSPN:ä GFRα4-sol pystyy edistämään RET:n fosforylaatiota, laukaisemaan PI-3K/AKT-reitin aktivaation, indusoimaan neuronaalista erilaistumista sekä tukemaan CGN-solujen eloonjäämistä. Löydöksemme sopivat hyvin yhteen vastikään julkaistujen tulosten kanssa, jotka osoittavat, että GFRα4-sol saattaa edesauttaa perinnöllisen syöpäsyndrooman, multippelin endokriinisen neoplasia tyyppi 2:n, puhkeamista. Tuloksemme antavat selityksen sille, miten GFRα4-sol voi aiheuttaa tai muunnella tätä sairautta.

Kaikkien nisäkkäiden GFRα4-reseptoreista puuttuu ensimmäinen Cys-pitoinen domeeni, joka on muissa GFRα-reseptoreissa. Työni viimeisessä osassa tutkin tämän domeenin toimintaa. Tein GFRα1-konstruktin, jota oli lyhennetty niin, että siitä puuttui ensimmäinen Cys-pitoinen domeeni. Käyttäen sitomiskokeita sekä solupohjaisissa että soluttomissa systeemeissä, RET:n fosforylaatiokokeita, sekä neuriittien uloskasvukokeita havaitsimme, että tämä ensimmäinen Cys-pitoinen domeeni edesauttaa GFRα1-reseptorin optimaalista toimintaa stabiloimalla GDNF:n ja GFRα1:n välistä interaktiota.

Julkaisun nimiösivu

This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.

© University of Helsinki 2006

Last updated 02.11.2006

Yhteystiedot, Contact information E-thesis Helsingin yliopisto, University of Helsinki