Helsingin yliopisto

 

Helsingin yliopiston verkkojulkaisut

University of Helsinki, Helsinki 2006

A study on bacteria-targeted screening and in vitro safety assessment of natural products

Kari Kreander

Doctoral dissertation, April 2006.
University of Helsinki, Faculty of Pharmacy, Division of Pharmaceutical Biology.

Tänä päivänä ilmaantuu yhä enemmän lääkkeille vastustuskykyisiä, tauteja aiheuttavia bakteereja, joihin nykyiset lääkkeet eivät tehoa. Luonto ja luonnosta peräisin olevat tuotteet ovat keskeisessä asemassa etsittäessä uusia lääkeaineita sekä niiden avulla kehitettäviä vaikuttavia aineita. Lääketeollisuus sekä eri tutkimuslaitokset ovat uusien haasteiden edessä etsiessään uusia vaikuttavia lääkeaineita. Tutkimuksen kannalta hyvin suunniteltu, kustannustehokas ja optimoitu lääkeaine seulonta on ensiarvoisen tärkeätä, jotta saavutetaan maksimaalinen tulos, minimaalisin voimavaroin. Tämän tavoitteen saavuttamiseksi käytetään pienemmässä mittakaavassa tehtäviä tutkimuksia miniatyrisoimalla ja optimoimalla jo käytössä olevia menetelmiä, mm. bakteerien kasvatuksessa 96-kuoppaisia levyjä hyödyntäen uusia nopeita mittalaitteita, sekä käytetään tietokoneavusteista laskentaa haettaessa uusia vaikuttavia lääkemolekyylejä. Samalla tutkimuksessa täytyy ottaa huomioon mahdolliset turvallisuustekijät kuten, lääkeaineen vaarallisuus ihmisellä sekä sen imeytyminen soluun ja vaikutus muihin lääkkeisiin.

Tutkimuksen lähtökohtana oli seuloa mahdollisia uusia vaikuttavia lääkeaineita luonnonperäisistä uutteista, niiden puhdasaineista sekä molekyylimallinnuksen kautta valittujen synteettisten yhdisteiden avulla. Tutkimukset suoritettiin bakteerisolumittakaavassa (/in vitro)/, käyttäen antibiootti erytromysiinille vastustuskykyisiä bakteerikantoja 96-kuoppalevyllä kasvattaen. Lisäksi osana tutkimusta pyrittiin selvittämään tutkittavien luonnosta peräisin olevien uutteiden turvallisuus, tutkimalla niiden mahdollisia muta- ja antimutageenisiä ominaisuuksia miniatyrisoidulla, 6-kuoppalevyllä, tehtävällä mutageenisyystestillä (Ames-testi). Ames-testi pyrkii simuloimaan ihmisen soluaineen vaihduntaa, jolloin mahdollisesti ihmiselle vaaralliset uutteet ja yhdisteet pystytään karsimaan jo tutkimuksen alkuvaiheessa. Lisäksi Ames-testin avulla pystytään osittain vähentämään eläinkokeita, joita lääketutkimuksessa joudutaan tekemään. Osa tutkittavista luonnonuutteista jaoteltiin nestekromatografian (HPLC) avulla fraktioihin 96-kuoppalevyille, jotta uutteiden vaikuttavat yhdisteet pystyttiin selvittämään. Lääkeaineiden tutkimuksen kannalta yksi suuri osa-alue on lääkkeiden imeytyminen ja miten mahdollinen uusia vaikuttava yhdiste vaikuttaa muiden jo käytössä olevien lääkkeiden imeytymiseen. Tätä asiaa tutkittiin käyttäen hyväksi Caco-2 eli ohutsuolen epiteeliä kuvaavaa solumallia, jota käytetään tutkittaessa yhdisteiden imeytymiskäyttäytymistä /in vitro/.

Väitöskirjassani pyrittiin selvittämään optimaaliset koeolosuhteet solupohjaisille menetelmille uusia vaikuttavia lääkeaineita luonnosta etsittäessä ja luonnonaineiden rakenteiden perusteella syntetisoitujen molekyylien avulla tehtävissä tutkimuksissa. Lisäksi tutkittavien uutteiden mahdolliset turvallisuusriskit pyrittiin seulomaan hyödyntämällä lääkkeiden imeytymiskokeita Caco-2-solulinjan avulla sekä Ames-testiä, joka oli pienenetty normaalista 9 cm halkaisijalla olevalta Petri-maljalta suoritettavasta testistä 6-kuoppalevylle tehtävään testiin jossa yhden kuopan halkaisija n.2.5 cm.

Tulokset

Työssä pystyttiin osoittamaan, että 96-kuoppalevyillä tehtävä antibakteeriseulonta on toimiva menetelmä uusien mahdollisten vaikuttavien lääkeaineiden seulonnassa. Pystyttiin myös osoittamaan kokeiden toistettavuus tilastollisin menetelmin. Nestekromatografian (HPLC) avulla fraktioitujen luonnonuutteiden sisältämien puhdasaineiden antimikrobiset vaikutukset onnistuttiin havaitsemaan ja menetelmä optimoimaan solupohjaiselle tutkimukselle.

Tietokoneavusteisen molekyylimallinnuksen avulla, käytettäessä kohdemolekyylinä tunnettua proteiinirakennetta, saavutettiin lääkekehityksen kannalta tutkimusta nopeuttavaa tietoa, jolloin tutkimukseen saatiin valittua mallinnuksen perusteella tutkimuksen kannalta parhaiten soveltuvat molekyylit. Luonnonaineiden vaikutuksia ihmissoluissa onnistuttiin jäljentämään pienessä mittakaavassa tehtävällä muta- ja antimutageenisuus Ames-testeillä, jolloin saavutetaan säästöä tarvittavien materiaalien määrässä, työvoimassa ja tilan tarpeessa. Osalla luonnonuutteista havaittiin olevan tunnettujen mutageenisten aineiden mutageenisuutta estävä vaikutus. Lisäksi tutkittavien luonnonuutteiden vaikutusta lääkeaineiden imeytymiseen tutkittiin Caco-2 solukokeilla, ja havaittiin kokeiden tarpeellisuus, koska osa uutteista joko edisti tai vähensi tunnettujen lääkeaineiden imeytymistä soluun.

Yhteenvetona voidaan sanoa, että tässä työssä onnistuttiin optimoimaan ja kehittämään menetelmiä joilla saavutetaan lääkkeenkehityksen kannalta tuloksia nopeammin, kustannustehokkaammin sekä vähentämään mahdollisten terveydelle haitallisten yhdisteiden jatkotutkiminen. Hyvin suunnitellusti tehdyllä tutkimuksella, uusia menetelmiä hyödyntäen pystytään saavuttamaan parempia tuloksia alati kiihtyvässä tarpeessa kehittää uusia lääkkeitä vastustuskykyisiä bakteerikantoja vastaan.

Julkaisun nimiösivu

This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.

© University of Helsinki 2006

Last updated 11.04.2006

Yhteystiedot, Contact information E-thesis Helsingin yliopisto, University of Helsinki