Helsingin yliopisto

 

Helsingin yliopiston verkkojulkaisut

University of Helsinki, Helsinki 2006

Lost in Translation: Translation Mechanisms in Production of Cocksfoot Mottle Virus Proteins

Katri Mäkeläinen

Doctoral dissertation, March 2006.
University of Helsinki, Faculty of Agriculture and Forestry, Department of Applied Chemistry and Microbiology, Microbiology.

Koiranheinän läikkäviruksen perintöaines koostuu yksisäikeisestä RNA:sta, joka voi toimia suoraan ohjeena, lähetti-RNA:na, viruksen proteiinien valmistamisessa. Koiranheinän läikkäviruksen RNA-ohjeen molemmista päistä kuitenkin puuttuvat elementit (nk. cap-rakenne ja poly(A)-häntä), jotka yleensä löytyvät solujen omista lähetti-RNA molekyyleistä ja jotka mahdollistavat niiden tehokkaan toimimisen proteiinisynteesin (translaation) ohjeistamisessa. Tutkimuksessa pyrittiin selvittämään niitä mekanismeja, joilla koiranheinän läikkäviruksen RNA-molekyyli pystyy kilpailemaan proteiinisynteesikoneistosta solun omien RNA-molekyylien kanssa. Mekanismia, jota koiranheinän läikkävirus käyttää proteiinisynteesinsä aloittamiseen, tutkittiin tarkastelemalla koiranheinän läikkäviruksen RNA:n 74:n ensimmäisen nukleotidin (nk. 5'pään ei-transloitavia alue) kykyä ohjata malliproteiinin tuottoa. Tupakassa elementit, jotka olivat peräisin kaksisirkkaisia kasveja infektoivista viruksista, toimivat tehokkaimmin. Tutkituista viruksista ainoastaan koiranheinän läikkävirus infektoi yksisirkkaisia kasveja. Ohrassa vain koiranheinän läikkäviruksen elementti tehosti malliproteiinin tuottoa, viitaten mahdolliseen isäntäspesifisyyteen. Proteiinituoton nousu ei kuitenkaan aiheutunut tehostuneesta proteiinisynteesistä vaan jostain aiemmasta geeniekspression vaiheesta. Vehnänalkiouutteessa suoritetut kokeet osoittivat, että koiranheinän läikkäviruksen RNA voi ohjata proteiinisynteesinsä alkamaan myös vaihtoehtoisella mekanismilla, jossa ribosomit tarttuvat suoraan translaation aloitusta ohjaavaan elementtiin sitoutumatta ensin RNA:n alkupäähän. Kokeet ohrasoluissa kuitenkin osoittivat, että jos RNA:n päässä on cap-rakenne, proteiinisynteesin aloitus tapahtuu samalla mekanismilla kun solun omille RNA-molekyyleille on tyypillistä.

Pienen kokonsa vuoksi myös virusten perimän koko on hyvin pieni ja se sisältää informaation vain rajallisen proteiinimäärän tuottamiseen. Virukset tuottavat pääsääntöisesti itse ainoastaan niitä proteiineja, joita isäntäsolulla ei ole niille tarjota. Tästä syystä positiivissäikeiset RNA virukset tuottavat itse oikeanlaisen RNA polymeraasi entsyymin, joka monistaa sen perintöaineksen. Koiranheinän läikkäviruksen kyseinen entsyymi tuotetaan nk. lukukehyksenvaihtomekanismilla. Viruksen RNA:ssa sijaitsevat signaalit pysäyttävät ja ohjaavat tietyn osan ribosomeista syntetisoimaan viruksen tarvitsemaa entsyymiä. Tutkimuksessamme havaitsimme, että koiranheinän läikkäviruksen signaalit ohjaavat noin 10-20% ribosomeista lukukehykseen, josta RNA polymeraasi tuotetaan. Huomasimme myös, että koiranheinän läikkävirus tuottaa proteiinia, joka näyttää estävän lukukehyksen vaihtumisen. Tämä viittaa siihen, että saavutettuaan tietyn pitoisuuden kyseinen proteiini saattaa pysäyttää viruksen RNA polymeraasin tuoton.

Koiranheinän läikkävirus tuottaa osan proteiineistaan yhtenä suurena polyproteiinina, joka pilkotaan toimiviksi yksittäisiksi proteiineiksi viruksen tuottaman proteaasi-entsyymin toimesta. Pilkkomista säätelee polyproteiinissa olevat alueet, jotka leikkaava proteaasi tunnistaa erilaisilla tehokkuuksilla. Tästä johtuen, pilkkomisen akana syntyy välituotteita, joiden ominaisuudet voivat erota lopputuotteista. Tämä on yksi tapa, jolla virukset voivat lisätä perintöaineksensa koodauskapasiteettia. Tutkimuksessa selvitettiin koiranheinän läikkäviruksen tuottaman proteaasin ominaisuuksia tutkimalla millaisia väli- ja lopputuotteita viruksella infektoiduista kasveista löytyy. Yksi proteaasin polyproteiinista tunnistama alue saatiin selville määrittämällä viruspartikkeleihin viruksen RNA:n mukana pakattavan proteiinin aminohapposekvenssi. Tutkimuksen perusteella huomattiin, että koiranheinän läikkäviruksen polyproteiinin pilkkomiseen käytettävät tunnistusalueet eroavat niistä sekvensseistä, joita muut sobemovirukset sekä läheiset sukulaisvirukset käyttävät.

Tulevaisuuden tavoitteena on saavutetun tiedon avulla löytää mahdollisuuksia vaikuttaa hyödyllisellä tavalla isäntä- ja transgeenien ilmentymiseen kasveissa.

Julkaisun nimiösivu

This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.

© University of Helsinki 2006

Last updated 22.03.2006

Yhteystiedot, Contact information E-thesis Helsingin yliopisto, University of Helsinki