Helsingin yliopisto

 

Helsingin yliopiston verkkojulkaisut

University of Helsinki, Helsinki 2006

Food and Indoor Air Isolated Bacillus Non-Protein Toxins:

Structures, Physico-Chemical Properties and Mechanisms of Effects on Eukaryotic Cells

Raimo Mikkola

Doctoral dissertation, December 2006.
University of Helsinki, Faculty of Agriculture and Forestry, Department of Applied Chemistry and Microbiology, Division of Microbiology.

Tämän väitöskirjan aiheena on sisäilmasta ja ruoka-aineista eristettyjen itiöitä muodostavien Basillusten tuottamien lämmönkestävien toksisten ei-proteiini yhdisteiden rakenne ja toksisuus nisäkäs soluille Basillusten erittämien toksisten ei-proteiini yhdisteiden esiintymisestä, vaikutuksista ja kulkeutumistavoista kosteusvaurioisten rakennusten sisäilmassa ei ole paljon tutkimustietoa. Basillukset muodostavat ilmassa liikkuvia itiöitä, jotka voivat toimia toksiinien kantajina, kuten sisäilmasta eristetyt toksisten sienien itiöt. Ruoka-aineissa Basillusten itiöt ovat ongelmana, koska ne kestävät ruuanvalmistuksessa käytettäviä lämpötiloja ja ovat valmiita lisääntymään ruoka-aineissa suotuisissa olosuhteissa.

Basillusten toksiset yhdisteet löydettiin käyttäen toksisuus indikaattorina sian siittiöiden liikkuvuuden muutosta toksisen altistuksen johdosta. Yhdisteiden puhdistuksessa, detektoinnissa ja rakenteen analysoimisessa käytettiin kaasu- ja nestekromatografiaa, massaspektrometriaa ja ydinmagneettista resonanssispektroskopiaa. Yhdisteiden toksisuutta ja vaikutustapoja tutkittiin käyttäen sian siittiöitä, kissan keuhkosoluja, ihmisen hermosoluja ja rotan maksasta eristettyjä mitokondrioita sekä BLM:ää (Black lipid membrane) ioniforisten ominaisuuksien selvittämiseen.

Tämän väitöskirjatyön tuloksena löydettiin uusi K+ > Na+ > Ca2+ ionikanavan muodostava toksiini joka sai nimen amylosiini. Amylosiinia tuottivat kosteusvaurioisen rakennuksen sisäilmasta eristetyt B. amyloliquefaciens kannat. Amylosiini puhdistettiin nestekromatografilla ja monoisotooppinen atomipaino 1197 Da selvitettiin sähkösumutusionisaatio ioniloukku massaspektrillä. Lisäksi sen todettiin olevan peptidi happohydrolyysin ja aminohappojen kaasukromatografisen massaspektrometri analyysin avulla. Sen rakenteen todettiin sisältävän kromoforisen polyeeni ryhmän käyttämällä ydinmagneettista resonanssispektroskopiaa. Amylosiinille kehitettiin nestekromatografinen kvantitointimenetelmä käyttäen makrolaktoni polyeenia amphoterisin B:tä (moolimassa 924 g/mol) referenssiaineena.

Ruoka-aine myrkytyksestä eristetty B. licheniformis kanta tuotti solukalvoa rikkovaa lipopeptidiä, likenysiini A:ta, joka puhdistettiin nestekromatografilla. Likenysiini A identifioitiin matriisiavusteisella laserionisaatio lentoaika-massaspektrometrillä sen tuottamien protonoituneiden sekä kationioituneiden ammonium, natrium, kalium molekyylien avulla. Sen tuottamat protonoidut molekyylit olivat m/z 1007, 1021 ja 1035. Likenysiini A:n aminohapot analysoitiin sähkösumutus-ionisaatio kolmoiskvadrupolin massaspektrometrin tuottaman tandem-massaspektrin sekä lipopeptidin happohydrolyysin ja aminohappojen nestekromatografisen analyysin avulla. Sisäilmasta eristetyn B. amyloliquefaciens kannan havaittiin tuottavan amylosiinin lisäksi lipopeptideja: sienille toksista fengysiinia ja solukalvoa hajottavaa surfaktiinia. Ne identifioitiin sähkösumutusionisaatio ioniloukku massaspektrillä niiden tuottamien protonoituneiden ja kationisoituneiden ammonium, natrium, kalium molekyylien sekä analysoimalla niiden tuottamat tandem massaspektrit. Surfaktiinin tuottamat protonoidut molekyylit olivat m/z 1009, 1023 ja 1037 ja fengysiinin m/z 1450, 1463, 1493 ja 1506.

Kereulidi (moolimassa 1152 g/mol) puhdistettiin nestekromatografisesti ruokamyrkytys tapaukseen liittyvästä B. cereus kannasta. Kereulidi identifioitiin sen sähkösumutusionisaatio kolmoiskvadrupoli massaspektrometrin tuottamien protonoidun molekyylin m/z 1154, ammonium m/z 1171, natrium m/z 1176 ja kalium m/z 1192 kationisoituneiden molekyylien avulla sekä tulkitsemalla kereulidin protonoidun molekyylin m/z 1154 tandem-massaspektrin tuote-ionit. Kereulidille kehitettiin nestekromatografinen kvantitointimenetelmä käyttäen sitä muistuttavaa valinomysiinia (moolimassa 1110 g/mol) referenssiaineena. Lisäksi osoitettiin empiirisesti, käyttämällä BLM:ää, että B. cereuksen tuottama emeettinen toksiini, kereulidi on tehokas ja spesifinen kalium ionifori, jonka toksinen vaikutus kohdistuu erityisesti mitokondrioiden toimintaan.

Julkaisun nimiösivu

This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.

© University of Helsinki 2006

Last updated 20.11.2006

Yhteystiedot, Contact information E-thesis Helsingin yliopisto, University of Helsinki