Browsing by Subject "CARS"

Maksan rasvoittumisen ajatellaan joskus olevan vain metabolisen oireyhtymän hyvälaatuinen maksamanifestaatio, vaikka se johtaa, erityisesti maksan fibrotisoituessa, kasvaneeseen kardiovaskulaarikuolleisuuteen ja pahimmillaan maksasyöpään. Tästä kansanterveydellisesti merkittävästä roolista huolimatta rasvamaksa on alidiagnosoitu ja sen patogeneettiset mekanismit ovat huonosti ymmärrettyjä, molemmat osin hyvien diagnostisten työkalujen puutteesta johtuen. Päätimme selvittää uusien non-lineaaristen kuvantamismodaliteettien soveltuvuutta rasvamaksan varhaisessa diagnostiikassa. Selvitimme 32 lihavuusleikkauspotilaan maksakudoskoepalojen kudosarkkitehtuurin perinteisin kudosvärjäysmenetelmin ja vertasimme tuloksia samojen potilaiden non-lineaarisesti kuvannettuihin näytteisiin. Kuvansimme minimaalisesti käsitellyistä jääleikkeistä coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) ja second harmonic generation (SHG) signaalit, joita hyödyntäen arvioimme näytteiden rasva- ja kollageenipitoisuuden. Kehitimme myös kuva-analytiikka-algoritmin, joka mahdollistaa kollageenisignaalin automatisoidun ja objektiivisen arvioimisen. Näytteistä mittaamamme SHG- ja CARS-signaalit korreloivat hyvin patologien arvioihin näytteiden fibrotisoitumis- ja rasvoittumisasteista, minkä lisäksi automatisoitu algoritmimme erotteli luotettavasti jopa varhaisen fibroosin normaalista kudoksesta. Myös terveiksi luokiteltujen näytteiden maksakudoksen keskellä esiintyi hienoa fibrillaarista SHG-signaalia. Tunnistamamme SHG-signaali oli spesifiä kolokalisoituen hyvin kollageeni-I- ja III-vasta-ainevärjäyksien kanssa. Tuloksemme osoittavat, että multimodaalisten kuvantamismenetelmien avulla voidaan tunnistaa maksan fibrillaarista kollageenia perinteisiä kudostutkimusmenetelmiä herkemmin. Kehittämämme kuva-analyysi-algoritmi puolestaan arvioi varhaisen fibroosin määrän nopeasti, objektiivisesti ja jatkuvalla skaalalla. Yhdessä nämä löydökset luovat edellytykset tutkia esimerkiksi maksan vähäisen fibroosin kliinistä merkitystä ja paranemistaipumusta isommissa potilasaineistoissa.

Ramansironta on sähkömagneettisen säteilyn ilmiö, jonka avulla voidaan havaita molekyylivärähdyksiä niistä sironneen valon avulla. Kun sähkömagneettinen säteily kohtaa molekyylin se voi häiritä elektronipilveä ytimen ympärillä ja prosessin lopputuloksena energiaa vapautuu sironneen säteilyn muodossa. Tätä kutsutaan epäelastiseksi sironnaksi. Mikäli sironnassa ei tapahdu fotonin energiassa muutosta kyseessä on elastinen siroaminen. Mikäli näytteeseen menevän ja sironneen fotonin välillä havaitaan energian muutos, käytetään ilmiöstä nimeä epäelastinen Raman sironta. Energian muutosta voidaan mitata, ja saatu spektri antaa tietoa kohdemolekyylistä. Tämän työn tarkoituksena oli tutkia eri Raman-spektroskopiatekniikoiden, lähinnä spontaani-Raman spektroskopian sekä koherentti anti-Stokes Ramanspektroskopian ja mikroskopian soveltuvuutta lääkemolekyylien havaitsemiseen sekä nanopartikkeleiden karakterisoinnissa ja nanopartikkeleiden ja solujen välisten interaktioiden tutkimisessa. Tekniikan vahvuuksiin kuuluu käytön suhteellinen helppous ja CARS-mikroskopian nopeus sekä korkea erotuskyky, mahdollisuus havainnoida solunäytteitä, ja epätodennäköisyys vaurioittaa tutkittavaa kohdetta. Haasteisiin lukeutuu fluoresenssin taipumus häiritä signaalia, spontaani-Raman mikroskopian heikompi erottelukyky, analyysin hitaus sekä tarve valikoida molekyyli, jonka rakenne antaisi vahvan Raman-signaalin. Tutkimuksen alatavoitteina oli sopivan lääkemolekyylin valitseminen nanopartikkeliformulaatioon, nanopartikkeleiden formulointi, niiden karakterisointi Raman-spektroskopiatekniikoilla, ja lopulta tutkia Raman spektroskopian soveltuvuutta nanopartikkeleiden ja lääkeaineen sekä solujen interaktioiden tutkimisessa ja lääkeaineen havaitsemisessa solujen sisältä. Tutkimuksessa uutta on se, että ensimmäistä kertaa polymeerinanopartikkeleiden ja niihin ladattujen lääkeaineiden soluunkulkeutumisen tutkiminen pelkällä Raman-spektroskopialla ilman esim. fluoresoivia merkkiaineita. Tutkimuksen tavoitteen pääasiallisesti täyttyivät. Valitsimme kohdemolekyyliksi klorotaloniilin, fungisidin joka on edullinen ja antaa selvästi tunnistettavan Raman-signaalin. Klorotaloniilille suoritettiin normaalit sytotoksisuuskokeet sekä vapaana lääkeaineena että formuloituina nanopartikkeleina. Nanopartikkelien formulointi onnistui ja molemmat Raman-spektroskopiatekniikat näyttivät selvästi sekä lääkemolekyylin että polymeerin kemikaalispesifiset Raman signaalit. Lääkemolekyylin havaitsemin solujen sisältä onnistui. Polymeerimolekyylit eivät missään vaiheessa kulkeutuneet solujen sisälle. Tämä oli ehkä yllättävää koska käytimme makrofageja, mutta toisaalta myös johdonmukainen muiden tutkimusten kanssa. Raman-tekniikat osoittautuivat hyviksi tutkimusmenetelmiksi, ja erityisesti CARS-mikroskoopin suuri erotuskyky osoittautui hyödylliseksi soluunkulkeutumisen kuvantamisessa.