Browsing by Subject "ELISA"

Aflatoxins are harmful compounds found in food and feed. The literature review of this thesis looked at aflatoxin M1 (AFM1) found in milk and its occurrence, significance and prevention methods using lactic acid bacteria (LAB). Furthermore, the assay methods of aflatoxins and the factors affecting the analysis were discussed. The aim of the experimental work was 1) to investigate the ability of five LAB strains to bind AFM1 in vitro and 2) to investigate how different matrixes affect the assay of AFM1 and to evaluate the feasibility of the selected ELISA kit for the study. In the first phase of the study the AFM1 concentrations of three different matrixes were analyzed using ELISA when known concentrations of the AFM1-standardsolution were added (0, 20 ja 40 ppt). In the second phase of the study the abilities of five LAB strains to bind AFM1 in UHT skimmed milk and MRS-broth were investigated. The bacterial suspensions were incubated at +32 °C for one hour, and the AFM1 concentration in the matrixes were 50, 15 and 10 ppt. The unbound AFM1 concentrations of the supernatants were analyzed from the samples using ELISA. The unbound AFM1 concentrations were converted to the proportional portion of the bound AFM1. In this study, statistically significant differences were observed in the abilities of the LAB to bind AFM1. The viable cells of strain B2 27 (Lb. plantarum-, pentosus- or paraplantarum) were the best binders of AFM1. They removed 43.7 % AFM1 in UHT skimmed milk, where the AFM1 concentration was 15 ppt. Unlike in previous studies viable cells bound AFM1 better than the heat-killed cells. The used ELISA kit was a sensitive method for analyzing low concentrations of AFM1, but at higher concentrations the assay results were inaccurate. The nonspecific interaction due to the components of the matrixes had to be taken into account when the results were reviewed. In the future, it may be possible to utilize the LAB strains, such as B2 27 for reducing AFM1 the concentration in milk and probably in other foodstuffs. There is a need to develop a practical application which can be used in the binding of AFM1 using lactic acid bacteria and thus reduce the bioavailability of AFM1.

Pahanlaatuisten veritautien ja luuytimen syöpien hoidossa käytetään allogeenista eli toiselta yksilöltä peräisin olevaa verta muodostavien kantasolujen siirrettä. Elintärkeän siirteen sivuvaikutuksena potilaalle voi kehittyä käänteishyljintäreaktio, jossa luovuttajan puolustusjärjestelmän solut vaurioittavat potilaan kudosrakenteita. Vaurioita kehittyy myös kateenkorvaan, elimeen, jossa immuunijärjestelmälle tärkeät T-solut kehittyvät ja ”kouluttautuvat”. Käänteishyljintäreaktion edetessä kateenkorva vaurioituu, minkä seurauksena elimistöön voi vapautua myös omia rakenteita vaurioittavia eli autoreaktiivisia T-soluja. Tiedetään, että T-solujen koulutus on häiriintynyt autoimmuunipolyendokrinopatia-kandidiaasi-ektodermidystrofiassa eli APECED:ssa (toiselta nimeltään APS1-oireyhtymä) sekä kateenkorvan epiteelisolujen kasvaimissa eli tymoomissa. APECED on autosomaalisesti peittyvästi periytyvä yhden geenin mutaation aiheuttama autoimmuunisairaus, jossa autoreaktiiviset T-solut aiheuttavat kudosvaurioita. Näissä sairauksissa potilailla on myös omia puolustusjärjestelmän sytokiineja estäviä vasta-aineita, niin kutsuttuja antisytokiini autovasta-aineita. Ajatellaan, että autoreaktiiviset T-solut osallistuvat kyseisten autovasta-aineiden muodostumiseen. Koska käänteishyljintäreaktio muistuttaa kateenkorvavaurioiltaan hieman APECED:a ja tymoomaa, syventävän projektini hypoteesina oli, että myös kroonisen käänteishyljintäreaktion potilailta löytyisi samoja antisytokiini autovasta-aineita kuin APECED:ssa ja tymoomassa. Huomio kiinnitettiin IFN-α 2a autovasta-aineiseen, mikä on yleisimpiä antisytokiini autovasta-aineita näissä sairauksissa. Tutkimusaineisto koostui 20:stä allogeenisen kantasolusiirteen saaneiden potilaiden seerumista, joista 18 kärsi kroonisesta käänteishyljinnästä. IFN-α 2a autovasta-aineen havaitsemiseksi käytettiin entsyymivälitteistä immunosorbenttianalyysiä, eli niin kutsuttua ELISA-menetelmää. Tutkimustulos oli negatiivinen eli potilasnäytteet eivät sisältäneet IFN-α 2a autovasta-ainetta. Tutkimushypoteesi oli täten väärä eli krooniseen käänteishyljintäreaktioon liittyvä kateenkorvavaurio ei aiheuta samanlaisia immunologisia vaikutuksia kuin APECED tai tymooma. Kateenkorvavaurion etiologia ja vaikutukset käänteishyljintäreaktiossa jäävät vielä avoimeksi ja selvittämiseksi vaaditaan tarkempaa solutason tutkimusta. Voi myös olla, että antisytokiini autovasta-aineiden muodostumiseen vaikuttavat muut, toistaiseksi tuntemattomat tekijät.

Tiivistelmä - Referat - Abstract Background. Platelets are known to contain ample amounts of brain derived neurotrophic factor. Previous spectrophotometric studies carried out in Pia Siljander’s lab have shown that BDNF is secreted from activated platelets packed in extracellular vesicles. For this project we wanted to 1) confirm that BDNF really is secreted in extracellular vesicles (EVs)2) find out how the choice of agonist affected the BDNF cargo of the platelet derived EVs, and 3) find out if the BDNF is packed into EVs of certain densities rather than others. Methods. The platelets were isolated from platelet concentrates by size exclusion chromatography. The isolated platelets were then activated by thrombin and collagen co-stimulation (TC) and by Ca2+ionophore, respectively. The platelet activation produced extracellular vesicles (PEVs) which were isolated by differential ultracentrifugation. The isolated PEVs were then analysed by flow cytometry, ELISA and Western blot for EV typical membrane surface proteins and for their BDNF content. As we were interested finding out whether BDNF is enriched in PEVs to certain populations, density gradient centrifugation was performed. These samples were also analysed by Western blot and by ELISA. The size distribution and concentration of PEVs in all samples was analysed by Nanoparticle tracking analysis. Results and conclusions. This study confirmed that platelets secrete PEVs as a response to agonists. PEVs with higher BDNF concentration were produced using TC co-stimulation as compared to PEVs derived from the Ca2+ionophore. The result implies that BDNF is actively packed into PEVs for instance as a thrombogenic response. Based on the density gradient results it seems that BDNF was packed into certain population of PEVs with a density between 1.112 g ml-1 and 1.132 g ml-1 corresponding to a particle diameter of less than 500 nm. The finding that BDNF is actively packed into TC co-stimulation derived PEVs of a certain population is interesting from a theragnostic point of view, since EVs are likely to be key players in the development of new cell-based therapies. Had there been more time, it would have been interesting to optimize both the density gradient protocol and the ELISA analysis. This optimization of methods would make the process more efficient, less prone to sample loss, not to mention that there would be less intra-assay variation.

Clostridium botulinum on anaerobinen, gram-positiivinen, itiöivä sauvabakteeri, jota esiintyy maailmanlaajuisesti maaperässä, meressä ja meren sedimenteissä. Se tuottaa maailman voimakkainta myrkkyä, botulinumneurotoksiinia (BoNT), joka aiheuttaa botulismina tunnetun velttohalvauksen estämällä asetyylikoliini -välittäjäaineen vapautumisen hermolihasliitoksen synapsiraossa. BoNT on n.150 kDa:n pituinen polypeptidiketju, joka koostuu disulfidisillalla yhdistetystä raskas- ja kevytketjusta. C. botulinum jaetaan kuuteen serotyyppiin A-F, joista C ja D aiheuttavat botulismia vain eläimillä. Linnut, turkiseläimet ja hevoset ovat herkimpiä C-tyypin toksiinille ja naudat ja pikkumärehtijät D-tyypille. Tyypit voidaan jakaa mikrobiologisten ominaisuuksiensa mukaan myös kolmeen ryhmään I-III. C- ja D- tyyppi muodostavat III-ryhmän, jolle on ominaista, että sen toksiinintuottogeeni sijaitsee bakteriofaagissa, toisin kuin muilla ryhmillä, joilla geeni kuuluu bakteerin kromosomiin. Bakteriofaagit ovat bakteerien loisviruksia, joita löytyy kaikkialta ympäristöstämme. Niillä on säännöllinen, usein kuusikulmainen pää ja tupellinen häntä. C- ja D-tyypin faagit sisältävät kaksijuonteista DNA:ta, jossa myös BoNT-geeni sijaitsee. Infektoidessaan bakteerin faagi siirtää DNA:nsa häntää pitkin bakteerin solulimaan. C- ja D-tyypin faagin suhde isäntäsoluunsa on pseudolysogeeninen, mikä tarkoittaa sitä, että faagi pystyy vaihdellen integroitumaan ja irrottautumaan bakteerin kromosomista. Integroiduttuaan kromosomiin faagi-DNA on lysogeenisessa syklissä eli se toimii osana isäntäsolun kromosomia ja periytyy sen mukana solun jälkeläisille. Irrottautuessaan kromosomista faagi-DNA joutuu solulimassa lyyttiseen sykliin, jossa se solun toimintaan puuttumatta monistaa itseään ja rakentaa päitä ja häntiä käyttöönsä. Lopulta uudet faagit rikkovat solun purkautuessaan siitä ulos. C- ja D-tyypit ovat toksigeenisiä ainoastaan infektoiduttuaan faagilla ja menettävät toksiinintuottokykynsä, jos faagi-DNA irrottautuu kromosomista. Faagityypistä riippuu, tuottaako solu C1- vai D-tyypin toksiinia. Kaikki faagit eivät kuitenkaan pysty infektoimaan kaikkia C- ja D-tyypin kantoja antigeenisista ja morfologisista eroista johtuen. Faagin menetykseen johtavia seikkoja ei tarkalleen tiedetä, mutta kasvulle epäedulliset ympäristöolot ja sarjasiirrostukset vähentävät kantojen toksigeenisyyttä. UV-säteilyllä ja erilaisilla kemiallisilla käsittelyillä faagit saadaan irtoamaan keinotekoisesti. Neurotoksiinit syntetisoidaan ei-toksisten proteiinien kanssa osana suurempia, erikokoisia toksiinikomplekseja. Proteiinit osallistuvat BoNT:n suojaamiseen ja kiinnittymiseen. Kompleksin rakentamisesta vastaa kuusi geeniä, joita koodataan kolmessa rykelmässä kahteen eri suuntaan. Osalla proteiineista on hemagglutinaatioaktiivisuutta, jonka mukaan HA-geenit on nimetty. Diagnostiikassa hiirikokeet ovat paljolti väistyneet uusien menetelmien tieltä, vaikka ne ovatkin yhä ainoa varma keino todeta toksiinin aktiivisuus. Immunologisista menetelmistä ELISA:a on paljon hyödynnetty C- ja D-tyypeillä. Detektioon on käytetty PCR:ää, mutta modernimpien geeniteknisten tyypitysmenetelmien osalta ei ole vielä julkaistuja tutkimustuloksia C- ja D-tyypeiltä. Sen sijaan ihmisbotulismia aiheuttavia tyyppejä on paljon tutkittu mm. ribotyypityksellä, PFGE:llä ja AFLP:llä.

The literature part of the study reviewed the recommended gluten quantification method, immunological ELISA R5. R5 is a monoclonal antibody that recognizes mainly the epitope that is abundant in especially gluten protein subgroup, ω-gliadin. The current PWG-gliadin reference material used in ELISA leads to inaccuracy of the gluten content, because it cannot represent sample materials that differ in their gliadin composition. The aim of the experimental study was to compare the prolamin compositions of different wheat cultivars and their reactivity against R5 antibody in sandwich ELISA. The aim was to find the most suitable ratio of barley prolamin, C-hordein, to be used as a reference material for wheat gluten quantification. The ω-gliadin proportions of different cultivars were calculated from RP-HPLC-chromatograms. In order to compare the total wheat gluten reactivity of the cultivars in ELISA R5 with gliadin standard and C-hordein in different ratios (10, 20 and 30% in BSA), Km-values that measure the rate of sensitivity in the assay, were calculated. The method to separate gliadin- and glutenin subgroups in RP-HPLC was optimized (solvent to extract gliadin and glutenin, temperature, injection volume, gradient). For cv. Crusoe the ω-, α/β- and γ-gliadins and HMW- and LMW-glutenins were identified. The selected wheat cultivars were categorized into four groups. The proportion of ω-gliadin in total gliadin ranged from 0.8 to 14.1% between the cultivars, whereas for PWG-gliadin this has been reported to be 7.7%. In terms of similar reactivity (Km-value) in ELISA, 20% C-hordein was found to be the most suitable reference material (Km 90) for the selected wheat cultivars (Km average 92), instead of the current gliadin standard (Km 68). The advantage of C-hordein standard is that the concentration and thus reactivity can be adjusted to match the sample materials with different prolamin profiles. Unlike with current gliadin reference material, it can be used without any conversion factors, which improves the method accuracy.

Ihmisellä on neljä immuuniglobuliini G:n alaluokkaa: IgG1, IgG2, IgG3 ja IgG4. IgG4:ään liittyvä sairaus on uusi systeeminen autoimmuunisairaus, joka voi ilmetä lähes missä tahansa elimessä, ja jonka eri ilmentymiä on aiemmin pidetty omina itsenäisinä sairauksinaan. Sairaus on hieman yleisempi ikääntyneillä ja miehillä. Sairaudelle on tyypillistä sidekudoksen ja IgG4-positiivisten plasmasolujen kertyminen kudoksiin. Merkittävällä osalla potilaista on myös kohonnut seerumin IgG4-pitoisuus. IgG4:ään liittyvälle sairaudelle on tyypillistä hyvä hoitovaste kortikosteroideille tai hankalissa tapauksissa B-soluja tuhoavalle CD20–vasta-aineelle. Suomessa IgG4:ään liittyvän sairauden hoito ei ole keskittynyt millekään lääketieteen erikoisalalle. Aiemman tutkimuksen mukaan IgG4-vaste on suuntautunut useita eri antigeeneja kohtaan. Tavoitteenamme oli selvittää, onko jokin erityinen antigeenityyppi potilaiden poikkeavan IgG4-vasteen kohteena. Käytimme jatkuvasti immuunijärjestelmän kohtaamia normaaliflooran mikrobeja, autoantigeenina toimivaa DNA:ta ja harvoin rokotuksissa kohdattavia tetanus- ja difteriatoksiineja. Keräsimme tutkimusta varten verinäytteitä vapaaehtoisilta potilailta kirjallisen informoinnin ja kirjallisen tutkimusluvan saamisen jälkeen. Potilaamme ovat peräisin Helsingin yliopistollisen keskussairaalan reumatologian poliklinikalta. Käytimme näytteiden analysointiin ELISA-menetelmää. Tulosten mukaan IgG4-pitoisuudet DNA:ta ja normaaliflooran mikrobeja kohtaan ovat potilailla terveitä verrokkeja korkeammat, mutta potilaiden vasteet harvoin kohdattavia rokotusantigeeneja kohtaan eivät merkittävästi eroa verrokkien vasteista. Havainto on mielenkiintoinen. Se tukee käsitystä potilaiden IgG4-vasteen suuntautumisesta useita eri antigeeneja kohtaan. Toisaalta se myös osoittaa antigeenityypin vaikuttavan IgG4-vasteeseen.

Kiiliäisten (Oestridae) heimoon kuuluva poron ihosaivartaja, Hypoderma (= Oedemagena) tarandi, kansankielellä kurmu, kuuluu porojen yleisimpiin ja samalla taloudellisesti merkittävimpiin parasiitteihin. Tämä syventävien opintojen projekti käsittää kirjallisuusosan ja tutkimusosan. Kirjallisuusosassa tarkastellaan poron Hypoderma tarandi -loisen elinkiertoa, esiintymistä ja merkitystä porotalouden kannalta, hypodermoosin immunologiaa ja työssä käytettyjen immunologisten menetelmien (western blottaus, ELISA ja IgG:n puhdistus proteiini G:n avulla) yleisiä periaatteita. Tutkimustyö tehtiin vuosina 1998-2001 Eltdk:n patologian laitoksella. Tutkimuksessa kehitettiin serologisia menetelmiä Hypoderma-vasta-aineiden osoittamiseen poron seeruminäytteissä. Serologisten menetelmien käyttöönoton hyötynäkökohtia ovat hypodermoosin epidemiologisen tutkimuksen helpottaminen, mahdollisuus löytää ja hoitaa seropositiiviset porot tartunnan varhaisvaiheessa eli ennen kuin toukat ehtivät aiheuttaa terveydellisiä haittoja ja vuotavaurioita sekä mahdollisesti vain tartunnan saaneiden porojen lääkitseminen. Tulevaisuudessa preventiivisen rokotteen kehittämiseen lähdettäessä tarvitaan luotettavat menetelmät myös vasta-aineiden osoittamiseen. Tutkimuksessa käytettiin antigeenina L2-L3-vaiheen kurmutoukkia ja primäärisenä vasta-aineena poron seeruminäytteitä. Antiseerumina käytettiin EELA:n ja Eltdk:n patologian laitoksen yhteistyössä valmistamaa kani-anti-poroa. Kaupallista vuohi-anti-kania käytettiin tunnistamaan kanin seerumi. Negatiivisena kontrollina käytettiin Korkeasaaren metsäpeurojen sekä supikoirien seeruminäytteitä. Western blottauksen ja ELISA:n perusteella saatiin selkeät viitteet siitä, että käytetyssä L3-vaiheen kurmuantigeenissa oli valmiiksi kiinni poron IgG:tä. Kyseessä voi olla kurmun adaptoima selviytymiskeino, jolla loinen pakenee isäntäeläimen immuunipuolustusta päällystäytymällä isännän antigeenilla. On myös mahdollista, että toukka on absorboinut poron vasta-aineet vähentääkseen omaa antigeenisuuttaan. Toisaalta tulokset voivat kertoa myös humoraalisen vasteen tehottomuudesta loisen torjumisessa. Menetelmää edelleen kehitettäessä voidaan kurmussa olevat vasta-aineet osoittaa ja lokalisoida esimerkiksi immunohistokemiallisella värjäyksellä jääleikkeistä tai paraffiinivalun avulla. Kurmuantigeeni voidaan myös yrittää puhdistaa siinä kiinni olevista immunoglobuliineista, jotka estävät seeruminäytteissä olevien vasta-aineiden luotettavan jäljittämisen.

Potato virus Y (PVY) is currently the most yield and quality limiting pathogen of the cultivated potato (Solanum tuberosum L.) globally. While yield losses specific to PVY are hard to measure in presence of other pathogens they are estimated as 20 to 80 %. The most important way by which the virus spreads are virus-infected seed potatoes. High quality seed potato is very important for food, food industry and starch potato production. Visual inspection of the potato plants underestimates usually the real percentage of PVY infection. Laboratory tests provide more accurate results about the incidence of infections. The problem with testing PVY is that the virus cannot be detected reliably from samples taken from dormant tubers. Different treatments have been used to break dormancy of tubers e.g. chemicals (Rindite, bromoethane), plant hormones (gibberellic acid) and adjusted storage temperatures (cold and heat treatment). The results have varied a lot. In this thesis an experiment with oxygen-carbon dioxide (O2 40 %-CO2 20 %) treatment with different periods of time was used to end dormancy of potato tubers. The aim was to test whether the treatment could end dormancy of tubers earlier than normally and to see if the treatment has an effect on detection of PVY. One aim was also to test how reliably PVY could be detected from tuber and sprout samples compared with potato leaf samples which are normally used for virus testing. Results from the sprouting treatment were variable and could not be readily generalized. The treatment had no effect on the detection of PVY incidence. When the different plant materials were compared with each other, tuber material showed the lowest PVY percentage when compared to sprouts and leaves. Testing sprouts also underestimated the incidence PVY. The best material for testing PVY in potatoes were the leaf samples.