Browsing by Subject "bakteriofagi"

Antibiootit ovat olleet suuressa roolissa mahdollistamassa nykyisten ruoantuotantoketjujen muodostumisen. Lemmikkieläinten määrä on samaan aikaan kasvanut ja lemmikkejä hoidetaan tänä päivänä yhä enemmän antibiooteilla. Antibioottien käyttö on kuitenkin johtanut antibiooteille vastustuskykyisten bakteereiden kehittymiseen, mikä vaikeuttaa jo nyt eläinten sekä ihmisten bakteeri-infektioiden hoitoa. Useat tahot tekevät työtä antibioottien vastuullisen käytön edistämiseksi ja resistenssiongelman torjumiseksi. Samalla on myös etsitty antibiooteille vaihtoehtoisia hoitomuotoja, joista bakteriofagit ovat yksi esimerkki. Bakteriofagit eli faagit ovat luonnossa esiintyviä, bakteereita infektoivia ja tuhoavia viruksia. Bakteriofagien monimuotoisuuden vuoksi jokaiselle bakteerille arvioidaan löytyvän sitä infektoimaan pystyvä faagi. Bakteriofagihoidolla tarkoitetaan bakteriofagien hyödyntämistä bakteeri-infektioiden hoidossa tai torjunnassa. Eläinten hoitoon bakteriofageja on käytetty ensimmäisen kerran jo 1920-luvulla eli ennen antibioottien löytämistä. Penisilliini ja muut tehokkaat antibiootit veivät kuitenkin huomion pois bakteriofageista, kunnes kiinnostus bakteriofageihin jälleen heräsi antibioottiresistenssin myötä. Bakteriofagihoidon onnistumisen kannalta on olennaista ymmärtää bakteerin, bakteriofagin ja elimistön välisiä vuorovaikutuksia. Hoitoon käytettävät bakteriofagit tulee valita huolella hoidon turvallisuuden sekä tehokkuuden takaamiseksi. Yksilöllisessä bakteriofagihoidossa taudinaiheuttajabakteeri eristetään ja juuri tälle patogeenille tehokkaista bakteriofageista valmistetaan hoitotuote. Toinen mahdollisuus on käyttää ennakolta valmistettuja hoitotuotteita, joita voidaan käyttää jo ennen patogeenin eristämistä. Bakteriofagihoidon erityispiirteisiin kuuluvat spesifisyys isäntäbakteerin suhteen, synergiaedut yhdistettyinä antibiootteihin tai toisiin faageihin sekä kustannustehokkuus. Eläimillä bakteriofagitutkimus on painottunut tuotantoeläimiin ja lemmikkieläimiä koskevia julkaisuja on vain muutamia. Tuotantoeläimillä tutkimusta on etenkin tehty yleisistä, taloudellisesti merkittävistä tai elintarvikehygieniaa vaarantavista sairauksista ja taudinaiheuttajista. Bakteriofagihoidon tehokkuus on ollut tutkimuksissa vaihtelevaa. Naudan utaretulehdus on yksi eniten tutkijoita kiinnostanut sairaus ja tältä osin bakteriofageilla ei pääsääntöisesti ole saavutettu haluttua hoitovastetta. Bakteriofageilla ei myöskään ole onnistuttu vähentämään metisilliinille resistentin Staphylococcus aureus -bakteerin (MRSA) määrää siassa. Sen sijaan bakteriofagien tehokkuudesta on saatu näyttöä vasikkaripulin, porsaiden vieroitusripulin ja koiran ulkokorvantulehduksen hoidossa sekä siipikarjassa zoonoottisesti merkittävien salmonella- ja kampylobakteerien torjunnassa. Myös useamman kalataudin torjunnassa bakteriofagien hyödyntämisessä on edistytty. Tutkimus eläinten bakteeri-infektioiden hoidosta bakteriofageilla on niukkaa. Saadut tulokset ovat vaihtelevia ja osittain myös keskenään ristiriitaisia. Antibiootteja täydentäville hoitomuodoille on aitoa tarvetta, ja bakteriofagit ovat ominaisuuksiensa takia mielenkiintoinen vaihtoehto. Kirjallisuuskatsauksen perusteella bakteriofagien mahdollinen soveltuvuus eläinten bakteeri-infektioiden hoitoon jää odottamaan lisätutkimuksia.

Antibiotic-resistant bacteria are an increasing threat to global health, caused by the excessive use of antibiotics and the lack of new antimicrobial agents being introduced to the market. New approaches to prevent and cure bacterial infections are needed to halt the growing crisis. One of the most promising alternatives is phage therapy which utilizes bacteriophages to target and kill pathogens with specificity. Pseudomonas aeruginosa is a common opportunistic pathogen that is intrinsically resistant to antibiotics, making it one of the most heavily studied targets of phage therapy. In this study, I characterized four P. aeruginosa phages, fHo-Pae01, PA1P1, PA8P1 and PA11P1, and evaluate their potency in therapeutic applications. Bioinformatic analysis of the genomes revealed the phages to be genetically highly similar and belonging to the Pbunavirus genus of the Myoviridae family. No genes encoding harmful toxins, antibiotic-resistance, or lysogeny were predicted. On the other hand, many of the predicted genes had unknown functions. The host ranges of the phages were assessed using 47 clinical P. aeruginosa strains and predicted host receptor binding tail proteins were compared. Some correlation between the host ranges and mutations in the tail proteins were observed but this alone was not sufficient to explain the differences in the host ranges. The recently isolated vB_PaeM_fHoPae01 (fHo-Pae01) phage was further characterized by a one-step growth curve and imaged with a promising atomic force microscopy method that had not been used before in the Skurnik group. Though the imaging results failed to provide any further knowledge of the phage, the 70-minute-long latent period of infection could be determined from the growth curve. Anion- exchange chromatography was found inefficient in purifying the fHo-Pae01 phage, so alternative methods such as endotoxin columns should be used when purifying these phages for patient use. In conclusion, all four phages appeared to be safe for therapeutic use based on current knowledge, and PA1P1 and PA11P1 were the most promising candidates due to their broad host ranges.

The objective of this thesis was to isolate and characterize new bacteriophages (phages) against clinical Klebsiella pneumoniae strains for phage therapy. K. pneumoniae is causing an emerging threat to global health due to its broad antibiotic resistance profile and hypervirulent strains. New treatment options are urgently needed to defeat the crisis. Phage therapy could provide one option to treat multiresistant K. pneumoniae infections. In this thesis, five new phages were isolated and characterized from Finnish wastewater and Georgian river water against two clinical K. pneumoniae strains. The three phages from Georgian river water, fMtkKpn01, fMtkKpn03, and fMtkKpn04, resembled Drulisviruses based on phylogenetic analysis. The two phages from Finnish wastewater, fJoKpn03 and fJoKpn05 were phylogenetically distinct. fJoKpn03 couldn’t be classified. fJoKpn05 resembled Weberviruses. Based on sequence analysis, none of the phage genomes included any harmful genes that would prevent their use in phage therapy. All phages demonstrated a 6-hour total inhibition to host bacterial growth. Their host range was determined to be narrow, only infecting their respective host strains from the 80 bacterial strains tested. All the phages tolerated high pH well. fJoKpn03 was the only one tolerating very low pH. All phages showed a synergistic effect on the inhibition of bacterial growth when applied together with piperacillin. In conclusion, all five phages proved potential for phage therapy. They demonstrated inhibitory action against K. pneumoniae strains with capsule types against which there previously were no phages in our collection. Due to their narrow host range, they could be suited for personalized phage therapy or used in combination therapy with antibiotics to increase efficacy and duration of action. fJoKpn03 could provide an opportunity for oral administration due to its broad pH stability profile.

Tämä maisterintutkielma on osa tutkimusohjelmaa, jossa on tarkoitus tunnistaa uusia antibioottien vaikutuskohteita bakteereissa. Tavoitteena oli pystyttää Haartman-instituutissa molekyylibiologinen menetelmä, jolla voitaisiin selvittää faagigeenien tuottamien proteiinien toksisuutta. Menetelmän kehityksessä korostui tarve pystyä analysoimaan tehokkaasti mahdollisimman monta tuntematonta faagigeeniä ja niiden toimintaa. Työssä kehitetty menetelmä perustui bioluminesenssin käyttöön toksisuuden havaitsemiseksi. Ensimmäisessä vaiheessa valmistettiin plasmidi, joka sisälsi luxAB-geenit. Työn toisessa vaiheessa muodostettiin itsemurhavektori, joka sisälsi luxCDE-geenit. Itsemurhavektorin sisältämät luxCDE-geenit integroitiin bakteerin genomiseen deoksiribonukleiinihappoon (gDNA), jonka jälkeen luxAB-geenit sisältävä plasmidi voitiin elektroporoida kyseiseen bakteeriin. Yhdessä nämä muodostivat geeniyhdistelmän luxCDABE, joka pystyi tuottamaan valoa bioluminesenssin avulla. Jos luxAB-plasmidiin kloonattavan geenin tuote on toksinen, eivät plasmidin saaneet transformantit elektroporaation jälkeen säily hengissä, minkä seurauksena transformantit eivät tuota valoa, kun taas, jos geenin tuote ei ole toksinen, tapahtuu valon tuottoa. Toisin sanoen, luminesenssin puuttuessa menetelmä toimisi halutulla tavalla eli indikoisi geenien tuottamien proteiinien toksisuutta. Menetelmän toimivuutta testattiin käyttämällä tunnettuja bakteerikantoja, jotka sisälsivät luxCDE-geenikasetin. Tarkoituksena oli varmistaa luxAB-geenien toimivuus komplementoida minkä tahansa bakteerin luxCDE-geenit. Tarkoitus oli saada aikaan menetelmä, jolla voidaan nopeasti ja tehokkaasti selvittää tuntemattomien faagigeenien toimintaa. Bioluminesenssin tuottama valo erottuu selkeästi ja menetelmä on helposti toistettavissa. Työssä kehitettyä luxAB-geenit sisältävää plasmidia voidaan jatkotutkimuksissa testata ensin tunnetuilla kontrolligeeneillä ja lopuksi käyttää toksisia proteiineja tuottavien faagigeenien tunnistamisessa.