Browsing by Subject "genotyypitys"

Clostridium botulinum on anaerobinen, gram-positiivinen, itiöivä sauvabakteeri, jota esiintyy maailmanlaajuisesti maaperässä, meressä ja meren sedimenteissä. Se tuottaa maailman voimakkainta myrkkyä, botulinumneurotoksiinia (BoNT), joka aiheuttaa botulismina tunnetun velttohalvauksen estämällä asetyylikoliini -välittäjäaineen vapautumisen hermolihasliitoksen synapsiraossa. BoNT on n.150 kDa:n pituinen polypeptidiketju, joka koostuu disulfidisillalla yhdistetystä raskas- ja kevytketjusta. C. botulinum jaetaan kuuteen serotyyppiin A-F, joista C ja D aiheuttavat botulismia vain eläimillä. Linnut, turkiseläimet ja hevoset ovat herkimpiä C-tyypin toksiinille ja naudat ja pikkumärehtijät D-tyypille. Tyypit voidaan jakaa mikrobiologisten ominaisuuksiensa mukaan myös kolmeen ryhmään I-III. C- ja D- tyyppi muodostavat III-ryhmän, jolle on ominaista, että sen toksiinintuottogeeni sijaitsee bakteriofaagissa, toisin kuin muilla ryhmillä, joilla geeni kuuluu bakteerin kromosomiin. Bakteriofaagit ovat bakteerien loisviruksia, joita löytyy kaikkialta ympäristöstämme. Niillä on säännöllinen, usein kuusikulmainen pää ja tupellinen häntä. C- ja D-tyypin faagit sisältävät kaksijuonteista DNA:ta, jossa myös BoNT-geeni sijaitsee. Infektoidessaan bakteerin faagi siirtää DNA:nsa häntää pitkin bakteerin solulimaan. C- ja D-tyypin faagin suhde isäntäsoluunsa on pseudolysogeeninen, mikä tarkoittaa sitä, että faagi pystyy vaihdellen integroitumaan ja irrottautumaan bakteerin kromosomista. Integroiduttuaan kromosomiin faagi-DNA on lysogeenisessa syklissä eli se toimii osana isäntäsolun kromosomia ja periytyy sen mukana solun jälkeläisille. Irrottautuessaan kromosomista faagi-DNA joutuu solulimassa lyyttiseen sykliin, jossa se solun toimintaan puuttumatta monistaa itseään ja rakentaa päitä ja häntiä käyttöönsä. Lopulta uudet faagit rikkovat solun purkautuessaan siitä ulos. C- ja D-tyypit ovat toksigeenisiä ainoastaan infektoiduttuaan faagilla ja menettävät toksiinintuottokykynsä, jos faagi-DNA irrottautuu kromosomista. Faagityypistä riippuu, tuottaako solu C1- vai D-tyypin toksiinia. Kaikki faagit eivät kuitenkaan pysty infektoimaan kaikkia C- ja D-tyypin kantoja antigeenisista ja morfologisista eroista johtuen. Faagin menetykseen johtavia seikkoja ei tarkalleen tiedetä, mutta kasvulle epäedulliset ympäristöolot ja sarjasiirrostukset vähentävät kantojen toksigeenisyyttä. UV-säteilyllä ja erilaisilla kemiallisilla käsittelyillä faagit saadaan irtoamaan keinotekoisesti. Neurotoksiinit syntetisoidaan ei-toksisten proteiinien kanssa osana suurempia, erikokoisia toksiinikomplekseja. Proteiinit osallistuvat BoNT:n suojaamiseen ja kiinnittymiseen. Kompleksin rakentamisesta vastaa kuusi geeniä, joita koodataan kolmessa rykelmässä kahteen eri suuntaan. Osalla proteiineista on hemagglutinaatioaktiivisuutta, jonka mukaan HA-geenit on nimetty. Diagnostiikassa hiirikokeet ovat paljolti väistyneet uusien menetelmien tieltä, vaikka ne ovatkin yhä ainoa varma keino todeta toksiinin aktiivisuus. Immunologisista menetelmistä ELISA:a on paljon hyödynnetty C- ja D-tyypeillä. Detektioon on käytetty PCR:ää, mutta modernimpien geeniteknisten tyypitysmenetelmien osalta ei ole vielä julkaistuja tutkimustuloksia C- ja D-tyypeiltä. Sen sijaan ihmisbotulismia aiheuttavia tyyppejä on paljon tutkittu mm. ribotyypityksellä, PFGE:llä ja AFLP:llä.

Utaretulehdus eli mastiitti on maailmanlaajuisesti lypsylehmien yleisin ja suurimmat taloudelliset tappiot aiheuttava sairaus. Kuluja aiheutuu muun muassa maidontuotantotappioista, hoitoon käytetyistä lääkkeistä sekä lehmien ennenaikaisesta teuraaksi laitosta. Streptococcus agalactiae on tärkeä lypsylehmien mastiittia aiheuttava patogeeni, joka leviää helposti karjassa. Sen on aiemmin ajateltu tarttuvan lähinnä vain lehmästä toiseen, mutta nykytietämyksen mukaan lehmä voi saada tartunnan myös esimerkiksi likaisesta navettaympäristöstä. Lisäksi tartunnan on epäilty olevan mahdollista siirtyä myös ihmisen ja lehmän välillä. Str. agalactiae tunnetaan ihmislääketieteessä vastasyntyneiden vauvojen hengenvaarallisen aivokalvontulehduksen aiheuttajana, jonka vauva saa synnytyksen yhteydessä äidiltään. Lypsylehmille Str. agalactiae aiheuttaa yleensä piilevän eli subkliinisen mastiitin, eikä se välttämättä aiheuta silminnähtäviä sairauden oireita. Tämän takia tartunta voi päästä leviämään karjassa nopeasti ja huomaamattomasti. Sairastuneiden nopea havaitseminen on kuitenkin tärkeää, jotta tartunnan leviäminen karjassa kyettäisiin tehokkaasti estämään. Suomessa yleisimmät Str. agalactiaen diagnosointimenetelmät ovat maitonäytteestä tehtävä perinteinen viljely sekä PCR-tutkimus. Toimenpiteitä Str. agalactiaen aiheuttaman mastiitin leviämisen ehkäisyssä ovat sairastuneiden lehmien karsiminen karjasta tai eristäminen muista eläimistä ja lääkitseminen. Lääkehoitona käytetään bentsyylipenisilliiniä intramammaarisuspensiona 3-5 vuorokauden ajan. Tartunta voi siirtyä uuteen karjaan esimerkiksi ostoeläinten mukana. Viime vuosikymmeninä tartuntojen määrä on pysynyt hallinnassa tehokkaiden vastustusohjelmien ja ennaltaehkäisytoimenpiteiden, kuten aktiivisen maitonäytteiden oton, ansiosta. Vuonna 2021 Str. agalactiae -positiivisten karjojen osuus Suomessa oli 2,2 %. Tartunnan saaneille lypsykarjatiloille suositellaan yleensä tautisaneerausta. Str. agalactiae -tautisaneerauksen onnistuminen vaihtelee tilojen välillä, ja siihen vaikuttavat esimerkiksi lääkehoidon ja sairaiden eristämisen onnistuminen karjassa, karjan utareterveystilanne sekä tilallisten motivaatio. Uusien tutkimusten ja mikrobiologisten tyypitysmenetelmien myötä lisääntynyt tieto tartuntareiteistä ja bakteerin eri kantojen ominaisuuksista on herättänyt kysymyksen siitä, vaikuttavatko kantojen vaihtelevat geneettiset ominaisuudet bakteerin kykyyn selviytyä lehmien elinympäristössä hengissä ja siten vaikuttaa myös tautisaneerauksen onnistumiseen. Str. agalactiaen eri kannoilla tiedetään olevan erilainen kyky muodostaa biofilmiä, rakentaa ulkopinnalleen säiemäisiä piluksia ja käyttää hyväkseen glukoosia energia-aineenvaihdunnassaan. Muun muassa nämä ominaisuudet vaikuttavat suuresti sekä bakteerin taudinaiheuttamiskykyyn että navettaympäristössä hengissä säilymiseen. Tämän kirjallisuuskatsauksen tavoitteena oli tarkastella Str. agalactiaen aiheuttamaa lypsylehmien mastiittia ja sen esiintyvyyttä sekä esitellä nykyään käytössä olevia tyypitysmenetelmiä, joiden avulla mastiittia aiheuttavia patogeenejä voidaan tunnistaa ja erotella ominaisuuksiensa mukaan. Lisäksi työssä perehdyttiin geneettisiin ominaisuuksiin, jotka edesauttavat Str. agalactiaeta sopeutumaan ja selviämään navettaympäristössä. Tulevaisuudessa Str. agalactiaen eri kantojen tyypitysmenetelmiä voitaisiin toivottavasti käyttää enemmän hyödyksi arvioitaessa tautisaneerauksen onnistumismahdollisuuksia.

Single nucleotide polymorphism (SNP) is DNA variation of a single nucleotide. SNPs are the most common mutations and millions of single nucleotide differences distinguish humans genetically from each other. Different gene variants of a single nucleotide affect nutritional and pharmacological metabolism and gene test results can therefore guide the diet and medication. SNPs are tested either by sequencing, gene arrays or quantitative polymerase chain reaction (qPCR). In this thesis the SNPs were tested by using 132 different TaqMan probes and the SmartChip qPCR platform. 20 participants donated two buccal swab samples and one dried blood spot (DBS) card. Buccal swabs were extracted using two different methods. DNA was also sent to a reference laboratory to be analysed by gene arrays and two participants also sent their DNA samples to two direct-to-consumer (DTC) commercial gene test companies. Low concentration buccal swab samples (<3 ng/µl) produced mismatches whereas DBS samples had high genotyping accuracy even at low DNA concentration. For buccal swabs there was a correlation between the DNA concentration and qPCR call rate (p<0.0001) but not for DBS samples (p>0.05). The allele separation of one TaqMan assay was not sufficient between minor homozygote and heterozygote clusters. For other 131 TaqMan assays excluding the low DNA concentration swab samples, the reproducibility rate was 99.97 %. The reproducibility rate with the DTC companies was 98.36 %. The lower reproducibility rate emphasizes the importance of the manual review of the genotyping raw data, which is not possible with huge sequencing or microarray SNP datasets. SNPs are found on various genetic structures which leads to inconsistent genotyping data that is difficult to analyse with a single algorithm. The SmartChip system combined with the TaqMan assays is a highly reproducible SNP genotyping method when the DNA concentration of the samples is high and the results are manually reviewed.