Browsing by Subject "genotyyppi"
Now showing items 1-9 of 9
-
(University of HelsinkiHelsingin yliopistoHelsingfors universitet, 2005)Clostridium botulinum on anaerobinen, gram-positiivinen, itiöivä sauvabakteeri, jota esiintyy maailmanlaajuisesti maaperässä, meressä ja meren sedimenteissä. Se tuottaa maailman voimakkainta myrkkyä, botulinumneurotoksiinia (BoNT), joka aiheuttaa botulismina tunnetun velttohalvauksen estämällä asetyylikoliini -välittäjäaineen vapautumisen hermolihasliitoksen synapsiraossa. BoNT on n.150 kDa:n pituinen polypeptidiketju, joka koostuu disulfidisillalla yhdistetystä raskas- ja kevytketjusta. C. botulinum jaetaan kuuteen serotyyppiin A-F, joista C ja D aiheuttavat botulismia vain eläimillä. Linnut, turkiseläimet ja hevoset ovat herkimpiä C-tyypin toksiinille ja naudat ja pikkumärehtijät D-tyypille. Tyypit voidaan jakaa mikrobiologisten ominaisuuksiensa mukaan myös kolmeen ryhmään I-III. C- ja D- tyyppi muodostavat III-ryhmän, jolle on ominaista, että sen toksiinintuottogeeni sijaitsee bakteriofaagissa, toisin kuin muilla ryhmillä, joilla geeni kuuluu bakteerin kromosomiin. Bakteriofaagit ovat bakteerien loisviruksia, joita löytyy kaikkialta ympäristöstämme. Niillä on säännöllinen, usein kuusikulmainen pää ja tupellinen häntä. C- ja D-tyypin faagit sisältävät kaksijuonteista DNA:ta, jossa myös BoNT-geeni sijaitsee. Infektoidessaan bakteerin faagi siirtää DNA:nsa häntää pitkin bakteerin solulimaan. C- ja D-tyypin faagin suhde isäntäsoluunsa on pseudolysogeeninen, mikä tarkoittaa sitä, että faagi pystyy vaihdellen integroitumaan ja irrottautumaan bakteerin kromosomista. Integroiduttuaan kromosomiin faagi-DNA on lysogeenisessa syklissä eli se toimii osana isäntäsolun kromosomia ja periytyy sen mukana solun jälkeläisille. Irrottautuessaan kromosomista faagi-DNA joutuu solulimassa lyyttiseen sykliin, jossa se solun toimintaan puuttumatta monistaa itseään ja rakentaa päitä ja häntiä käyttöönsä. Lopulta uudet faagit rikkovat solun purkautuessaan siitä ulos. C- ja D-tyypit ovat toksigeenisiä ainoastaan infektoiduttuaan faagilla ja menettävät toksiinintuottokykynsä, jos faagi-DNA irrottautuu kromosomista. Faagityypistä riippuu, tuottaako solu C1- vai D-tyypin toksiinia. Kaikki faagit eivät kuitenkaan pysty infektoimaan kaikkia C- ja D-tyypin kantoja antigeenisista ja morfologisista eroista johtuen. Faagin menetykseen johtavia seikkoja ei tarkalleen tiedetä, mutta kasvulle epäedulliset ympäristöolot ja sarjasiirrostukset vähentävät kantojen toksigeenisyyttä. UV-säteilyllä ja erilaisilla kemiallisilla käsittelyillä faagit saadaan irtoamaan keinotekoisesti. Neurotoksiinit syntetisoidaan ei-toksisten proteiinien kanssa osana suurempia, erikokoisia toksiinikomplekseja. Proteiinit osallistuvat BoNT:n suojaamiseen ja kiinnittymiseen. Kompleksin rakentamisesta vastaa kuusi geeniä, joita koodataan kolmessa rykelmässä kahteen eri suuntaan. Osalla proteiineista on hemagglutinaatioaktiivisuutta, jonka mukaan HA-geenit on nimetty. Diagnostiikassa hiirikokeet ovat paljolti väistyneet uusien menetelmien tieltä, vaikka ne ovatkin yhä ainoa varma keino todeta toksiinin aktiivisuus. Immunologisista menetelmistä ELISA:a on paljon hyödynnetty C- ja D-tyypeillä. Detektioon on käytetty PCR:ää, mutta modernimpien geeniteknisten tyypitysmenetelmien osalta ei ole vielä julkaistuja tutkimustuloksia C- ja D-tyypeiltä. Sen sijaan ihmisbotulismia aiheuttavia tyyppejä on paljon tutkittu mm. ribotyypityksellä, PFGE:llä ja AFLP:llä.
-
(University of HelsinkiHelsingin yliopistoHelsingfors universitet, 2005)Vuonna 1995 kehitettiin DNA-mikrosiruihin perustuva menetelmä tutkia yhtäaikaisesti tuhansia geenejä. Menetelmää on siitä lähtien sovellettu monilla tieteenaloilla mm. syöpätutkimuksessa, lääkkeiden kehittämisessä ja genomiikan tutkimuksessa. Viimeisen kymmenen vuoden aikana on ilmestynyt lukuisia julkaisuja, jotka käsittelevät DNA-mikrosirutekniikan sovelluksia eri biotieteen aloihin. Tässä työssä luodaan yleiskatsaus DNA-mikrosirutekniikan perusperiaatteisiin sekä esitellään sen käyttöä elintarvikepatogeenien tutkimuksessa. Elintarvikepatogeenitutkimuksissa DNA-mikrosirutekniikkaa on käytetty lähinnä viiteen tarkoitukseen: diagnostiikkaan, genotyypitykseen, evolutiivisen genomiikan tutkimuksiin, geeniekspressiotutkimuksiin ja isäntä-patogeeni-vuorovaikutuksen tutkimiseen. DNA-mikrosirutekniikalla on nykyään useita variaatioita, mutta periaate on kaikissa sama: lastumaiselle tukimateriaalille, esimerkiksi mikroskooppilasille, on erittäin tiheään asetettu tutkittavia geenejä edustavat koettimet. Näytteen DNA-juosteet kiinnittyvät emäspariperiaatteen mukaisesti (A-T ja G-C) kukin omalle koettimelleen. Tämän pariutumistapahtuman tuloksia luetaan mikrosirulta ja analysoidaan. Näyte-DNA saadaan eristämällä tutkimuskohteesta DNA:ta tai RNA:ta, joka käännetään käänteistranskriptiolla komplementaariseksi DNA:ksi. DNA-mikrosirukokeeseen liittyy monia eri vaiheita: 1. Mikrosirun valmistus 2. Näytteen valmistus ja leimaus 3. Hybridisaatio 4. Tulosten lukeminen mikrosirulta 5. Tulosten käsittely ja analyysi 6. Koetulosten tulkinta DNA-mikrosirutekniikan suurimmat edut ovat sen tarkkuus ja nopeus. Geenit pystytään tunnistamaan ja erottamaan toisistaan tarkasti niiden spesifisen emäsjärjestyksen perusteella ja yhdellä kokeella saadaan tietoa koko genomista. Tekniikan ongelmat liittyvät toisaalta juuri valtavaan tietomäärään, jota on vaikea käsitellä ja tulkita sekä kokeen monivaiheisuuteen, mikä lisää virhemahdollisuutta. Lisäksi menetelmä on monilta osin vielä hyvin kallis.
-
(2014)Hepatitis C virus (HCV) is a globally significant blood-borne agent causing liver diseases. HCV has infected over 170 million people worldwide and it has become a significant causative agent of chronic liver inflammation also in Finland. HCV is a very diverse group of viruses that is divided into genotypes 1–7 as well as subtypes. HCV infection can be treated with antiviral drugs, and the drug of choice as well as treatment success are determined by the HCV genotype that the patient is carrying. The aim of this study was to develop a new, sequencing based HCV genotyping method for the Laboratory of the Hospital District of Helsinki and Uusimaa (HUSLAB), at the Department of Virology and Immunology. The focus of the study was to establish a steady and robust genotyping method that would be suitable for the workflow in clinical diagnostics. The samples used in this study had been previously analysed in regular HCV genotyping diagnostics at HUSLAB. The genomic regions chosen for amplification with several different primer options were 5’UTR, core/E1 and NS5B. 5’UTR turned out to be the only suitable option for the diagnostic workflow. The amplification products were sequenced using Sanger method. Amplification of the whole HCV genome in several different reaction conditions for 454 deep sequencing was also attempted to obtain information about possible mixed infections and drug resistance changes in the genome. In this study, a new HCV genotyping method based on Sanger sequencing of the 5’UTR region was successfully established. The method is robust, stable and suitable for the use in clinical diagnostics. The established HCV genotyping method is the first entirely sequencing-based method in clinical viral diagnostics in Finland. The secondary aim, amplification of the whole HCV genome using a method suitable for the workflow of clinical diagnostics was not achieved. Given the demands and restrictions of the workflow of clinical diagnostics we can conclude that routine HCV genotyping with deep sequencing methods is for the present not yet possible.
-
(University of HelsinkiHelsingin yliopistoHelsingfors universitet, 2007)Rotaviruses are double-stranded RNA-viruses. They are members of the family Reoviridae and are the cause of severe gastroenteritis in young humans and animals. Primary infection is the most severe and reinfections usually produce only mild symptoms. Worldwide about 600 000 children die every year from rotavirus infection, and this figure represents about 5 % of all deaths in children younger than five years. Virtually all children will be infected by the time they reach one year of age. Because primary infection is so severe, rotavirus vaccines have been developed. Surveillance studies are needed to monitor the vaccine impact on circulating viral strains. It is important to know whether some strains disappear and new strains, possibly from animals, emerge. This rotavirus genotyping study is part of a long-term European surveillance study, which tries to define and monitor rotavirus types circulating in Europe. Proteins VP4, VP6 and VP7 are the primary antigens of rotaviruses. Rotavirus is classified into serogroups A-G based on inner layer protein VP6. Group A-C rotaviruses are human pathogenes. Most human rotavirus diseases are caused by group A rotavirus. The group A rotaviruses are further classified into G and P types based on the outer layer proteins VP4 and VP7. 15 G and 14 P types have been identified in humans. In this study we established G and P types for 200 rotavirus samples by using nested-PCR. Materials consisted of stool samples originated from HUSLAB virology department and Kuopio University Hospital. Rotavirus positive stool samples taken from children during years 2005-2007. RNA was extracted from stool suspensions and it was translated to DNA and amplified by nested-PCR. As first step RNA was transcripted to cDNA by reverse transcription. cDNA was amplified from gene segment areas that code for VP4 and VP7 proteins. As second step these PCR-products were amplified using G and P type-specific primers. Final PCR products were G and P typed by using agarose electrophoresis. We find that most common G types in 2005-2007 were G1 and G9; other G types was also found. Most common P type was P[8], which constituted 90 % of all viruses. The most common G and P combinations were G1P[8] and G9P[8]. In epidemic season 2006-2007 the most common G types in Helsinki were G1 and G9. In Kuopio predominant stains were G2 and G9. The most common G and P combinations in epidemic season 2006-2007 were G1P[8] and G9P[8] in Helsinki and G9P[8] and G2P[4] in Kuopio. In recent years the most common G types in Europe have been G1-G4 and G9. Finnish genotype distribution is mainly congruent with G and P types in other European countries.
-
(2021)This thesis was undertaken to determine effects of genotype, vernalization and harvesting on the root growth of grass plants. Greenhouse experiments were carried out at Viikki experimental farm of University of Helsinki. The thesis was a part of a larger research of grasses. Grass species were two timothy (Phleum pratense L.) parental lines, northern (021/1) and southern (B112) genotype (Boreal Plant Breeding Ltd). The trial material was propagated using the plant material conserve of Viikki. A half of the trial material got a vernalization treatment (10 weeks) after pre-breeding (2 weeks, DL 12 h) and the other half of plants got only pre-breeding (3 weeks, DL 12h) before establishment of two separate trials in rhitsotubes and rhitsotrones. High, growth stage, dry matter of shoots and roots, depth of the root system and shoot to root ratios were measured from rhitsotubes seven times during the study. The growth samples from rhitzotrones were collected twice. The harvesting was done in the middle of the study from both separate trials. Genotype had an influence on all measured growth features in both separate trials. Treatments of southern genotypes were mainly higher, development was faster and dry matter of shoots was greater at harvest time compared to the same treatments of the northern genotype. There were no differences on growth features between genotypes in the end. The dry matter of roots was also greater at the harvest time with treatments of the southern genotype. In the end of the trial there were no differences between genotypes or treatments, but the genotype influenced on root growth in repeated measurements between weeks 6-8. The root system of the southern genotype spread out in deeper soil layers with both treatments and survived better after harvesting compared to treatments of the northern genotype. The vernalization had influence on growth features and the root system with most of the occasions of measurements with both the genotypes. The vernalization reduced biomass of roots in the both separate trials. This was partly due to low weight of shoots especially in the beginning of the study. In the other hand the vernalization improved on development before the harvesting and the carbohydrates allocated on shoots instead of roots. This was visible especially in the rhitsotubes. Differences between vernalized and non-vernalized treatments were levelled towards the end of the study. The vernalization increased growth of roots to deeper soil layers comparing to the non-vernalized treatment with the northern genotype. In weekly monitoring the growth of roots of both the vernalized genotypes were strong before ending the study. This might cite better overwintering but in the other hand shoot to root ratios were almost the same in all treatments. This study showed out that a plant tries to keep the growth of shoots and roots in balance but also that the biomass allocates in shoots in the beginning of the growing season and more in roots after harvesting. According to this study adding the southern genetic heritage to the timothy refinement programs brings higher yield level and moreover more abundant and deeper root system.
-
(2021)This thesis was undertaken to determine effects of genotype, vernalization and harvesting on the root growth of grass plants. Greenhouse experiments were carried out at Viikki experimental farm of University of Helsinki. The thesis was a part of a larger research of grasses. Grass species were two timothy (Phleum pratense L.) parental lines, northern (021/1) and southern (B112) genotype (Boreal Plant Breeding Ltd). The trial material was propagated using the plant material conserve of Viikki. A half of the trial material got a vernalization treatment (10 weeks) after pre-breeding (2 weeks, DL 12 h) and the other half of plants got only pre-breeding (3 weeks, DL 12h) before establishment of two separate trials in rhitsotubes and rhitsotrones. High, growth stage, dry matter of shoots and roots, depth of the root system and shoot to root ratios were measured from rhitsotubes seven times during the study. The growth samples from rhitzotrones were collected twice. The harvesting was done in the middle of the study from both separate trials. Genotype had an influence on all measured growth features in both separate trials. Treatments of southern genotypes were mainly higher, development was faster and dry matter of shoots was greater at harvest time compared to the same treatments of the northern genotype. There were no differences on growth features between genotypes in the end. The dry matter of roots was also greater at the harvest time with treatments of the southern genotype. In the end of the trial there were no differences between genotypes or treatments, but the genotype influenced on root growth in repeated measurements between weeks 6-8. The root system of the southern genotype spread out in deeper soil layers with both treatments and survived better after harvesting compared to treatments of the northern genotype. The vernalization had influence on growth features and the root system with most of the occasions of measurements with both the genotypes. The vernalization reduced biomass of roots in the both separate trials. This was partly due to low weight of shoots especially in the beginning of the study. In the other hand the vernalization improved on development before the harvesting and the carbohydrates allocated on shoots instead of roots. This was visible especially in the rhitsotubes. Differences between vernalized and non-vernalized treatments were levelled towards the end of the study. The vernalization increased growth of roots to deeper soil layers comparing to the non-vernalized treatment with the northern genotype. In weekly monitoring the growth of roots of both the vernalized genotypes were strong before ending the study. This might cite better overwintering but in the other hand shoot to root ratios were almost the same in all treatments. This study showed out that a plant tries to keep the growth of shoots and roots in balance but also that the biomass allocates in shoots in the beginning of the growing season and more in roots after harvesting. According to this study adding the southern genetic heritage to the timothy refinement programs brings higher yield level and moreover more abundant and deeper root system.
-
(2016)The woodland strawberry (Fragaria vesca) exists almost in the entire Northern Hemisphere. Short daylength and low temperature induce flowering in autumn. Flowering begins in the next growing season when daylength becomes longer and temperature increases. The aim of this study was to find out the critical daylength for flower induction in woodland strawberry genotypes from different latitudes. The aim was to find out differences in vegetative growth, flowering and FT-gene expression between different genotypes in three daylengths. In this study ten different genotypes from different latitudes were used as the plant material. There were three daylength treatments; 12h, 14h and 16h. After six weeks of treatments plants were moved to greenhouse where the daylength was long (18h). In this study the number of stolons and crowns, petiole length, flowering time and the number of inflorescences were observed. In addition RNA was isolated from five genotypes and the expression of FT-gene was determined. The beginning of flowering depended on daylength and genotype. The northern genotypes began to flower soon after all treatments and they also formed more inflorescences than the southern genotypes. The southern genotypes flowered last and only after 12h and 14h treatments. FT-gene expression was noticed only in 16h daylength and the expression was the strongest in southern genotypes which didn´t begin flowering in this treatment. The petiole lengths were shorter in northern genotypes than in southern genotypes. The number of crowns depended on daylength. In 12h daylength there were more crowns than in 16h daylength. On the other hand there weren´t differences in the number of crowns between the genotypes. The critical daylength for flower induction depends on the latitude of the origin. The critical daylength for flower induction was noticed to be over 16h in Norwegian genotypes. The critical daylength for flower induction is over 14h but under 16h in Finnish and Central Europe genotypes. In southern genotypes the critical daylength for flower induction is over 12h but under 14h. Longer daylengths enhance vegetative growth except crown branching.
-
(University of HelsinkiHelsingin yliopistoHelsingfors universitet, 2006)Clostridium botulinum on ehdottoman anaerobinen gram-positiivinen sauvabakteeri ja vaarallinen ruokamyrkytyspatogeeni. Sen tuottama hermomyrkky, botulinumtoksiini, aiheuttaa hengenvaarallista botulismia ihmisillä ja eläimillä. C. botulinum muodostaa itiöitä, jotka säilyvät äärimmäisissäkin ympäristöolosuhteissa. C. botulinum -kannat jaetaan metabolisten ominaisuuksiensa perusteella ryhmiin I-IV, joista ryhmät I ja II ovat ihmisille vaarallisia neurotoksiineja tuottavia. Ryhmän I kannat ovat proteolyyttisiä ja ryhmän II kannat ei-proteolyyttisiä. Bakteerin tuottaman toksiinin tyypin perusteella kannat jaetaan toksinotyyppeihin A-G, joista ryhmään I kuuluvat tyypit A, B ja F sekä ryhmään II tyypit B, E ja F. Koska samaa toksinotyyppiä olevia kantoja esiintyy sekä ryhmässä I että ryhmässä II, pelkän toksinotyypin perusteella kantojen erottelu ryhmiin ei ole mahdollista. Samaa toksinotyyppiä olevissa eri metabolisiin ryhmiin kuuluvissa kannoissa ainoa yhteinen tekijä on tuotetun toksiinin tyyppi. C. botulinum -kantojen tyypittämiseksi ryhmiin on tällä hetkellä käytössä erilaisia molekyylibiologisia menetelmiä, sekä perinteinen mikrobiologinen menetelmä jolla saadaan selville kannan proteolyyttisyys tutkimalla sen kykyä hajottaa kaseiinia. Molekyylibiologisista menetelmistä mainittakoon AFLP ja ribotyypitys. Menetelmien ongelmina ovat mm. niiden hitaus ja työläys sekä perinteisessä mikrobiologiassa epätarkka tulkinta. Tässä tutkimuksessa etsittiin ryhmien I ja II C. botulinum -kantoja erottelevat geenialueet DNAmikrosirutekniikan avulla. Ryhmien I ja II kaikista eri toksino-tyyppisistä (ryhmä I: A, B, F; ryhmä II: B, E, F) C. botulinum -kannoista eristetyt puhtaat DNA-näytteet leimattiin fluoresoivalla merkkiaineella ja hybridisoitiin C. botulinum ATCC 3502 DNA-mikrosirulle kilpailevaa hybridisaatiota käyttäen. Kontrollina käytettiin C. botulinum ATCC 3502 -kannan DNA:ta. DNA-mikrosirulla oli koettimina PCR-tuotteet ATCC 3502 -kannan kaikista geeneistä. Siten kaikkien näiden geenien läsnäoloa näytteessä pystyttiin tutkimaan yhdellä DNA-mikrosirukokeella. DNA:n hybridisaatioastetta koetinkohtaisesti tutkimalla etsittiin suurimman logaritmisen intensiteettieron ryhmien I ja II välillä antaneet geenialueet. Tunnistettujen alueiden perusteella suunniteltiin kuusi ryhmän I kannoille spesifistä alukeparia, joista kahden (CBO0250F/R ja CBO1073F/R) toimivuus testattiin 60 ryhmän I ja II eri toksinotyyppisellä C. botulinum -kannalla. PCR-menetelmä ryhmien I ja II erottamiseksi toisistaan optimoitiin käyttäen alukeparia CBO0250F/R, joka erotteli tarkasti kaikki 60 testattua C. botulinum -kantaa ryhmiin I ja II. Kehitetyllä PCR- menetelmällä voidaan erotella C. botulinum -kannat ryhmiin I ja II aikaisempiin molekyylibiologiin menetelmiin verrattuna huomattavasti nopeammin ja perinteisiin menetelmiin verrattuna luotettavammin. Menetelmä soveltuu rutiinikäyttöön C. botulinum -kantojen ryhmiin I ja II tyypittämiseen. Yksinkertaisten ja nopeiden tyypitysmenetelmien käyttö osana C. botulinumin diagnostiikkaa olisi tärkeää tautitapausten epidemiologisessa selvitystyössä, ja niitä tulisikin ottaa mahdollisimman paljon rutiinikäyttöön.
-
(2018)Timoteitä (Phleum pratense L.) viljellään Suomessa karjalle rehuksi. Sen kasvuston rakenne vaikuttaa satoon ja sadon ominaisuuksiin. Typpilannoituksen, vernalisaation ja genotyypin kaikkia vaikutuksia näihin ominaisuuksiin ei vielä tiedetä tarkkaan. Tietoa tarvitaan uusien lajikkeiden typpilannoitussuositusten kehittämiseen sekä avuksi timotein lajikejalostuksessa sopeuduttaessa ilmastonmuutokseen ja maataloustuotannon kestävään tehostamiseen. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää miten typpilannoitus, vernalisaatio ja kasvin perimä vaikuttavat timotein kasvustorakenteeseen ja miten typpi vaikuttaa vernlaisaatio geeneihin ja kukintaan. Kokeessa oli mukana kaksi timotein genotyyppiä, eteläinen (BorE) ja pohjoinen (BorP), jotka eroavat toisistaan vernalisaatiovaatimukseltaan. Typpitasoja oli kolme, jotka vastasivat peltolannoituksen tasoja 11,6 kg N/ha (N1), 278,3 kg N/ha (N2) ja 545,0 kg N/ha (N3). Kasvit joko vernalisoitiin 10 viikon ajan tai niitä ei vernalisoitu ennen siirtoa kasvihuoneelle pitkään päivään. Kasveista mitattiin viikottain korren pituus, versojen lukumäärä ja lehtien lukumäärä, sekä kokeen lopussa kuiva-aineen kertyminen sekä versotyyppien lukumäärä (GEN, ELONG, VEG). Kasveista kerättiin näytteitä ennen pitkään päivään tai vernalisaatioon siirtämistä sekä 1-4 vk kasvihuoneelle siirron jälkeen RNA näytteet, joista analysoitiin PpVRN1 ja PpVRN3 geenien ilmeneminen qPCR analyysillä. Typpilannoitus vaikutti tilastollisesti merkittävästi kaikkiin mitattuihin tekijöihin kasvustorakenteessa. Typpi lisäsi erityisesti versojen lukumäärää ja se alensi tai viivästytti erityisesti PpVRN3 geenin ilmenemistä. Vernalisoimattomassa BorE kasveissa typpi lisäsi myös GEN versojen lukumäärää. Typellä oli kaiken kaikkiaan tilastollisesti merkittävä vaikutus VRN geenien ilmenemiseen. Lisäksi genotyyppi vaikutti kasvustorakenteen siten, että BorE olivat keskimäärin korkeampia. Timotein genotyyppi vaikutti typen vasteeseen ainoastaan korsijakauman kautta. Typpilannoituksella ja sen määrällä havaittiin olevan vaikutusta timotein kasvustorakenteeseen, kukkivien versojen lukumäärään sekä vernalisaatiogeenien ilmenemiseen. Typen vaikutukset eivät kuitenkaan olleet yksiselitteisiä vaan yhdysvaikutuksia esiintyi runsaasti. Typen vaikutukset kukintaan oli selkeämpi BorE kasveissa, mikä voi viitata siihen, että vernalisaatiolla ja sen vaatimuksella voi olla merkitystä genotyypin typpivasteeseen.
Now showing items 1-9 of 9