Browsing by Subject "hlyA"

Työn tarkoituksena oli pystyttää reaaliaikainen PCR-menetelmä enterohemorraagisten Escherichia coli (EHEC) seroryhmien O26, O55, O91, O111, O113, O145 ja O157 sekä H7-antigeenin ja virulenssigeenien stx1, stx2 ja hlyA nopeampaa havaitsemista varten. Työssä testattiin menetelmän soveltuvuutta EHEC-bakteerien havaitsemiseen 45 puhdasviljelmäkannan lisäksi myös seitsemästä sekaviljelmästä, joista yksi oli Nokian vesiepidemian vesinäyte. Puhdasviljelmäkannat ja kuusi muuta sekaviljelmää olivat peräisin sairaaloista vuosien 1996-2007 välisenä aikana lähetetyiltä sekaviljelmämaljoilta. EHEC-bakteerit kuuluvat suolistotulehduksia aiheuttaviin E. coli-bakteereihin. Ne ovat suolistotulehduksia aiheuttavista E. coli-ryhmistä tärkein elintarvikevälitteisten ripulien aiheuttaja Suomessa ja muissa länsimaissa. EHEC-bakteerit leviävät pääasiallisesti elintarvikkeiden ja juomaveden kautta, vaikkakin alkuperäinen kontaminaatio on aina saanut alkunsa ihmisen tai eläimen ulosteesta. EHEC-infektion voi saada jo 10–100 bakteerista ja sen onkin todettu tarttuneen ihmisestä toiseen. Bakteerin tärkein reservuaari on nautakarjan ja muiden märehtijöiden suolistossa. EHEC-infektioita tavataan yleensä n. 10–20 tapausta vuosittain Suomessa. Suomessa, kuin myös maailmanlaajuisesti, yleisin epidemioita aiheuttanut EHEC-kanta on tähän mennessä kuulunut O157:H7-serotyyppiin. Muita tärkeitä epidemioita aiheuttaneita O-seroryhmiä Suomessa ja muualla maailmalla ovat olleet seroryhmät O26, O103, O111 ja O145. EHEC-bakteeri aiheuttaa vesiripulia, mutta potilaat voivat kärsiä myös vatsakivuista ja oksentelusta. Osalla ihmisistä vesiripuli voi muuttua myös veriripuliksi (Hemorragic Colitis, HC). Jotkut voivat olla myös oireettomia kantajia. EHEC-bakteerin aiheuttama ripuli voi kehittyä hemolyyttis ureeminen oireyhtymä (haemoltyic uremic syndrome, HUS- jälkitaudiksi, jonka oireina ovat akuutit munuaisvaurioit, mikroangiopaattinen hemolyyttinen anemia ja trombosytopenia. Aikuisilla voi esiintyä myös HUS:n tromboottiseksi trombosytopeeniseksi purppuraksi (trombotic trombocytopenic purpura, TTP) kutsuttua muotoa. HUS:n riskiryhmään kuuluvat alle viisivuotiaat lapset ja vanhukset. EHEC-bakteerin aiheuttama tauti luokitellaan Suomessa yleisvaarallisiin tartuntatauteihin. EHEC-bakteerin virulenssitekijöihin lukeutuu shigatoksiinin tuottogeenien (stx1- ja stx2-geenit) lisäksi myös Enterohemolysiinin tuottogeeni (hly-geeni) ja LEE (Locus of Enterocyte Effacement)-patogeenisuus saareke, joka sisältää mm. tir- ja eae-geenit, jotka määräävät proteiineja, joiden välityksellä EHEC-bakteeri kiinnittyy suolen epiteeliin. Shigatoksiineja pidetään oireiden pääasiallisena aiheuttajana. Tässä työssä testattu reaaliaikainen PCR-menetelmä (Real-Time PCR) on uusimpia EHEC-bakteerin tunnistamiseen käytetyistä menetelmistä. Menetelmä hyödyntää fluoresoivia koettimia, jotka toimivat fluoresenssi resonanssilla eli energian siirtymisellä (Fluorescense Resonance Energy Transfer, FRET) kahden fluoresoivan leiman kesken. Menetelmä mahdollistaa PCR-tuotteen analysoimisen monistamisen yhteydessä ja vähentää analysoimisen aikana syntyvän kontaminaatioriskin lisäksi myös turvallisuusriskiä, kun tulosten visualisoinnissa ei tarvitse käyttää karsinogeenista Etidiumbromidia (EtBr). Tässä työssä menetelmällä saadut tulokset olivat toistettavia ja vastasivat aiemmin monialukkeisella PCRmenetelmällä ja agglutinaatiotekniikalla saatuja tuloksia. Sekaviljelmiä testatessa reaaliaikaisen PCR-menetelmän kanssa samanaikaisesti rinnakkain tehty monialukkeinen PCR-menetelmä antoi myös yhtenevät tulokset. Reaaliaikainen PCR-menetelmä osoittautui monialukkeista PCR-menetelmää ja agglutinaatiotekniikkaa huomattavasti nopeammaksi menetelmäksi, joka mahdollistaa nopeamman diagnoosin, joka on tärkeää HUS-jälkitautia sairastavien potilaiden hoidon kannalta.