Browsing by Subject "itiöinti"

Clostridium botulinum on anaerobinen bakteeri, joka tuottaa vahvinta luonnollista myrkkyä, botuliinineurotoksiinia. Botuliinitoksiini aiheuttaa ihmisille ja eläimille botulismina tunnettua velttohalvausta, joka voi johtaa kuolemaan. C. botulinum -bakteeria ja sen itiöitä esiintyy maaperässä sekä vesistöissä, minkä vuoksi bakteereja ja siten niiden tuottamaa toksiinia voi päätyä myös elintarvikkeisiin. C. botulinum -bakteerin toksiinierityksen säätely on vielä osittain tuntematonta. Toksiinintuottoon ja toksiinineritykseen liittyvien mekanismien parempi ymmärtäminen lisäisi mahdollisuuksia parantaa elintarviketurvallisuutta. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia itiönmuodostuksen pääsäätelijä Spo0A-proteiinia koodaavaa spo0A-geeniä ja botuliinitoksiinikompleksin toksista osaa koodaavaa botA-geeniä ihmiselle botulismia aiheuttavassa ryhmän I C. botulinum ATCC19397 -kannassa. Geenien toimintaa tutkittiin CRISPR-Cas9–menetelmällä valmistettujen spo0A- ja botA-deleetiomutanttien avulla. Mutanttikannasta mitattuja ominaisuuksia verrattiin mutatoimattoman villityypin kannan tuloksiin. Itiönmuodostus on C. botulinum -bakteereille tärkeä aineenvaihdunnan tapahtuma, ja kasvatusliemessä itiöinti sekä toksiinituotanto käynnistyvät samanaikaisesti. C. botulinumin ryhmän II bakteereilla Spo0A-proteiinin on todettu säätelevän positiivisesti botuliinitoksiinin tuotantoa. Oletimme tämän säätelyn olevan käytössä myös ryhmän I C. botulinum -bakteereilla, joten oletimme toksiinituotannon vähenevän spo0A-mutantilla. Hypoteesina oli myös, että spo0A-mutantin itiönmuodostus lakkaa. Oletimme, että botA-mutantti ei tuottaisi toksiinia toksiinigeenin puuttuessa. botA-mutanttikannan oletettiin kasvavan nopeammin sekä muodostavan tiheämmän kasvuston kuin villityypin kanta, kun mutanttikannalta ei kulu energiaa suuren toksiiniproteiinin rakentamiseen ja se voi käyttää enemmän energiaa kasvuunsa. Tutkimuksen lopuksi poistetut geenit palautettiin mutantteihin, jotta varmistettiin havaittujen muutosten johtuneen geenien poistamisesta. Tutkituista mutanttikannoista mitattiin optista tiheyttä spektrofotometrillä, laskettiin elävien solujen ja itiöiden määrää MPN (most probable number) -menetelmällä, mitattiin toksiinieritystä immunologisella testillä (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) sekä geenien ilmentymistä RT-qPCR-menetelmällä. Itiöiden ja elävien solujen esiintymistä tutkittiin myös kvalitatiivisesti mikroskopoimalla. Odotusten mukaisesti spo0A-mutantti ei muodostanut itiöitä eikä botA-mutantti muodostanut toksiinia. spo0A-geenin poisto johti toksiinituotannon merkittävään vähenemiseen sekä transkriptiotasolla että eritetyn toksiinin määrässä. Tutkimuksessamme totesimme Spo0A:n säätelevän toksiinituotantoa ryhmän I C. botulinum -bakteereilla. botA-mutantin kasvunopeus ei ollut hypoteesin mukainen, vaan se kasvoi samalla tavalla kuin villityypin kanta. Spo0A:n positiivinen säätelyvaikutus botA-toksiinigeeniin on merkittävä löydös, sillä se viittaisi samojen säätelymekanismien olevan käytössä universaalisti ryhmien I ja II C. botulinum -kannoilla. Löydös linkittää C. botulinum -bakteereille kaksi hyvin merkittävää aineenvaihdunnan tapahtumaa, toksiinintuotannon ja itiöitymisen, toisiinsa. Toksiinituotannon ja itiöinnin käynnistymisen yhteinen säätely on bakteerille todennäköisesti energiatehokasta. Yhteinen säätely auttaa bakteeria todennäköisesti varmistamaan itselleen suotuisat elinolosuhteet ja elinkierron jatkumisen.