Protein aggregation (literature review) : Soluble expression of human Ciliary neurotrophic factor in Escherichia coli (experimental work)

Proteiinit ovat endogeenisiä molekyylejä, jotka suorittavat lähes kaikki solun toiminnot ja ovat solun normaalille toiminnalle välttämättömiä. Proteiinit muodostuvat polypeptidiketjuista, jotka laskostuessaan normaalisti muodostavat stabiilin ja toimintakykyisen kolmiulotteisen rakenteen. Proteiinien stabiilius on riippuvainen ympäristön tekijöistä (pH, lämpötila, ionivahvuus, jne.) ja niiden keskinäisistä vuorovaikutuksista. Useimmilla proteiineilla niiden biologinen toiminta on läheisesti kytköksissä niiden rakenteeseen. Proteiinien vääränlainen laskostuminen tai laskoksen aukeaminen johtaa usein proteiinien ryvästymiseen eli aggregaatioon. In vivo proteiinien aggregaation tiedetään olevan osallisena aiheuttajana vaikeissa ja tappavissa sairauksissa, kuten Alzheimerin ja Parkinsonin taudissa, sekä verkkokalvon ikärappeumassa. In vitro, proteiinien fysikaalisen ja kemiallisen epästabiiliuden uskotaan johtavan aggregaatioon. Tämä on suuri huolenaihe varsinkin biofarmaseuttiselle teollisuudelle, sillä se rajoittaa proteiinilääkkeiden valmistuprosessin tehokkuutta. Tärkeämpänä syynä on kuitenkin proteiiniaggregaattien vahva immunogeeninen luonne, joka voi aiheuttaa vakavia seurauksia potilaissa. Proteiinien aggregaation mekanismit ovat monimutkaisia ja huonosti ymmärrettyjä. Biologisten lääkkeiden potilasturvallisuutta koskevat säännökset vaativat proteiinilääkeformulaatioilta proteiiniaggregaattien analyysiä ja karakterisointia. Tämä katsaus antaa yleiskuvan proteiiniaggregaatiosta ja keskittyy biologisten lääkkeiden proteaggregaattien analyysissa ja karakterisoinnissa käytettyihin metelmiin. Neurotrofiset tekijät vaikuttavat keskushermoston neuronien eloonjäämiseen, erilaistumiseen, leviämiseen ja säädeltyyn kuolemaan. Ihmisen siliaarisella hermokasvutekijällä (human Ciliary neurotrophic factor, hCNTF) on neuroneja suojaava ominaisuus ja sen tunnetaan vaikuttavan myös energiatasapainoon. Tästä syystä CNTF:llä onkin potentiaalista terapeuttista käyttöä neurodegeneratiivisten tautien ja aineenvaihduntatautien hoidossa. Tälläisia tauteja ovat esimerkiksi liikalihavuus ja diabetes. CNTF:n kliininen ja biologinen käyttö vaatii rekombinanttien ilmennysmenetelmien käyttöä, jotta voidaan tuottaa suuria määriä toiminnallista proteiinia. Aikaisemmissa tutkimuksissa on raportoitu rekombinantin CNTF:n Eschrecchia coli (E. coli) -soluissa tapahtuva ilmentäminen on rajoittunut alhaisen saannon vuoksi ja vaatii usein proteiinin uudelleenlaskostusta inkluusiojyväsistä. Tässä raportissa kuvaamme menetelmän, jolla voi seuloa tehokkaasti eri konstrukteja ja ilmentämisolosuhteita liukoisen hCNTF:n tuottamiseen E. coli-soluissa. Liukoisen proteiinien ilmentymistä havaittiin useimmilla liukoisen fuusioproteiinin ja kodonioptimoidulla hCNTF-sekvenssin yhdistelmillä ja tutkituissa ilmentämisolosuhteissa. Fuusiokonstruktin 6-His-CNTF havaittiin ilmentyvän liukoisena kaikissa tutkituissa olosuhteissa. Havaintomme viittaavat hCNTF:n sekvenssin kodonioptimoinnin olevan riittävä aikaansaamaan hCNTF:n ilmentyminen liukoisena E. coli-soluissa. Rekombinantin hCNTF:n havaittiin sitoutuvan CNTFRα:aan EC50-arvolla 36 nM.