Skip to main content
Login | Suomeksi | På svenska | In English

Protein aggregation (literature review) : Soluble expression of human Ciliary neurotrophic factor in Escherichia coli (experimental work)

Show simple item record

dc.date.accessioned 2014-11-27T13:58:58Z und
dc.date.accessioned 2018-07-03T14:44:56Z
dc.date.available 2014-11-27T13:58:58Z und
dc.date.available 2018-07-03T14:44:56Z
dc.date.issued 2014-11-27
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/10138/144179
dc.title Protein aggregation (literature review) : Soluble expression of human Ciliary neurotrophic factor in Escherichia coli (experimental work) en
ethesis.discipline Biofarmaci sv
ethesis.discipline Biopharmacy en
ethesis.discipline Biofarmasia fi
ethesis.faculty Farmaceutiska fakulteten sv
ethesis.faculty Faculty of Pharmacy en
ethesis.faculty Farmasian tiedekunta fi
ethesis.faculty.URI http://data.hulib.helsinki.fi/id/9a2784ea-4d84-40d4-a651-895ae66a37ea
ethesis.university.URI http://data.hulib.helsinki.fi/id/50ae46d8-7ba9-4821-877c-c994c78b0d97
ethesis.university Helsingfors universitet sv
ethesis.university University of Helsinki en
ethesis.university Helsingin yliopisto fi
dct.creator Itkonen, Jaakko
dct.issued 2014
dct.language.ISO639-2 eng
dct.abstract Proteins are endogenous molecules that carry out most biological functions in vivo. They are called as the biological workhorses. Proteins are made up of polypeptide chains that usually fold in the three dimensional space to adopt a native stable conformation. Stability of proteins is dependent on the interplay of environmental factors (pH, temperature, ionic strength). For most proteins, the biological function closely relates to the structural attributes of the protein. Misfolding or unfolding of proteins often result in aggregation. Protein aggregation in vivo is known to cause debilitating and fatal diseases such as Alzheimer's, Huntington's, Parkinson's and age related macular degeneration (AMD). Instability (physical and chemical) of proteins in vitro is believed to result in aggregation. This is a huge concern for the biopharmaceutical industry as it not only limits the effectiveness of the manufacturing process but also poses a great risk of fatality in vivo due to the immunogenic nature of the aggregates. Mechanisms of protein aggregation are complex and not well understood. Regulatory requirements for patient safety in biopharmaceutical products require characterization and analysis of aggregates in protein drug formulations. This review provides an overview of protein aggregation in general and highlights the different analytical methods used to characterize protein aggregates in biopharmaceuticals. Neurotrophic factors influence survival, differentiation, proliferation and death of neuronal cells within the central nervous system. Human ciliary neurotrophic factor (hCNTF) has neuroprotective properties and is also known to influence energy balance. Consequently, hCNTF has potential therapeutic applications in neurodegenerative, obesity and diabetes related disorders. Clinical and biological applications of CNTF necessitate a recombinant expression system to produce large amounts of functional protein. Previous studies have reported that recombinant expression of CNTF in Escherichia coli (E. coli) was limited by low yields and the need to refold the protein from inclusion bodies. In this report, we describe a strategy to effectively screen fusion constructs and expression conditions for soluble hCNTF production in E. coli. Most conditions tested with the codon optimized hCNTF sequence in fusion with soluble tags resulted in soluble expression of the protein. The construct 6-His-CNTF showed soluble expression in all the conditions tested. Our results suggest that codon optimization of the hCNTF sequence is sufficient for soluble expression in E. coli. The recombinant hCNTF was found to bind to CNTFRα with an EC50 = 36 nM. en
dct.abstract Proteiinit ovat endogeenisiä molekyylejä, jotka suorittavat lähes kaikki solun toiminnot ja ovat solun normaalille toiminnalle välttämättömiä. Proteiinit muodostuvat polypeptidiketjuista, jotka laskostuessaan normaalisti muodostavat stabiilin ja toimintakykyisen kolmiulotteisen rakenteen. Proteiinien stabiilius on riippuvainen ympäristön tekijöistä (pH, lämpötila, ionivahvuus, jne.) ja niiden keskinäisistä vuorovaikutuksista. Useimmilla proteiineilla niiden biologinen toiminta on läheisesti kytköksissä niiden rakenteeseen. Proteiinien vääränlainen laskostuminen tai laskoksen aukeaminen johtaa usein proteiinien ryvästymiseen eli aggregaatioon. In vivo proteiinien aggregaation tiedetään olevan osallisena aiheuttajana vaikeissa ja tappavissa sairauksissa, kuten Alzheimerin ja Parkinsonin taudissa, sekä verkkokalvon ikärappeumassa. In vitro, proteiinien fysikaalisen ja kemiallisen epästabiiliuden uskotaan johtavan aggregaatioon. Tämä on suuri huolenaihe varsinkin biofarmaseuttiselle teollisuudelle, sillä se rajoittaa proteiinilääkkeiden valmistuprosessin tehokkuutta. Tärkeämpänä syynä on kuitenkin proteiiniaggregaattien vahva immunogeeninen luonne, joka voi aiheuttaa vakavia seurauksia potilaissa. Proteiinien aggregaation mekanismit ovat monimutkaisia ja huonosti ymmärrettyjä. Biologisten lääkkeiden potilasturvallisuutta koskevat säännökset vaativat proteiinilääkeformulaatioilta proteiiniaggregaattien analyysiä ja karakterisointia. Tämä katsaus antaa yleiskuvan proteiiniaggregaatiosta ja keskittyy biologisten lääkkeiden proteaggregaattien analyysissa ja karakterisoinnissa käytettyihin metelmiin. Neurotrofiset tekijät vaikuttavat keskushermoston neuronien eloonjäämiseen, erilaistumiseen, leviämiseen ja säädeltyyn kuolemaan. Ihmisen siliaarisella hermokasvutekijällä (human Ciliary neurotrophic factor, hCNTF) on neuroneja suojaava ominaisuus ja sen tunnetaan vaikuttavan myös energiatasapainoon. Tästä syystä CNTF:llä onkin potentiaalista terapeuttista käyttöä neurodegeneratiivisten tautien ja aineenvaihduntatautien hoidossa. Tälläisia tauteja ovat esimerkiksi liikalihavuus ja diabetes. CNTF:n kliininen ja biologinen käyttö vaatii rekombinanttien ilmennysmenetelmien käyttöä, jotta voidaan tuottaa suuria määriä toiminnallista proteiinia. Aikaisemmissa tutkimuksissa on raportoitu rekombinantin CNTF:n Eschrecchia coli (E. coli) -soluissa tapahtuva ilmentäminen on rajoittunut alhaisen saannon vuoksi ja vaatii usein proteiinin uudelleenlaskostusta inkluusiojyväsistä. Tässä raportissa kuvaamme menetelmän, jolla voi seuloa tehokkaasti eri konstrukteja ja ilmentämisolosuhteita liukoisen hCNTF:n tuottamiseen E. coli-soluissa. Liukoisen proteiinien ilmentymistä havaittiin useimmilla liukoisen fuusioproteiinin ja kodonioptimoidulla hCNTF-sekvenssin yhdistelmillä ja tutkituissa ilmentämisolosuhteissa. Fuusiokonstruktin 6-His-CNTF havaittiin ilmentyvän liukoisena kaikissa tutkituissa olosuhteissa. Havaintomme viittaavat hCNTF:n sekvenssin kodonioptimoinnin olevan riittävä aikaansaamaan hCNTF:n ilmentyminen liukoisena E. coli-soluissa. Rekombinantin hCNTF:n havaittiin sitoutuvan CNTFRα:aan EC50-arvolla 36 nM. fi
dct.subject hCNTF
dct.subject E. Coli
dct.subject biopharmaceuticals en
dct.subject excipients en
dct.subject stability en
dct.subject formulation en
dct.subject codon optimization en
dct.subject factorial screening en
dct.subject soluble expression en
dct.subject biologiset lääkkeet fi
dct.subject apuaineet fi
dct.subject stabiilisuus fi
dct.subject formulaatio fi
dct.subject kodonioptimointi fi
dct.subject tekijöihin perustuva seulonta fi
dct.subject liukoinen ilmennys fi
dct.language en
ethesis.language.URI http://data.hulib.helsinki.fi/id/languages/eng
ethesis.language English en
ethesis.language englanti fi
ethesis.language engelska sv
ethesis.supervisor Sarkhel, Sanjay
ethesis.supervisor Urtti, Arto
ethesis.thesistype pro gradu -avhandlingar sv
ethesis.thesistype pro gradu -tutkielmat fi
ethesis.thesistype master's thesis en
ethesis.thesistype.URI http://data.hulib.helsinki.fi/id/thesistypes/mastersthesis
dct.identifier.urn URN:NBN:fi-fe201801151277
dc.type.dcmitype Text

Files in this item

Files Size Format View
Master's Thesis_Jaakko Itkonen.pdf 2.529Mb PDF

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record