Verihiutaleperäisten mikrovesikkeleiden kvantifiointi ja karakterisointi

Mikrovesikkelit (MV) ovat proteiineja, lipidejä, RNA:ta ja DNA:ta sisältäviä kaksoiskalvollisia vesikkeleitä, joita tuotetaan useimmista soluista. MV:llä on rooli monissa fysiologisissa tapahtumissa ja niiden määrä sekä sisältämät molekyylit on pystytty yhdistämään erilaisiin patofysiologisiin ilmiöihin. Tulevaisuuden tavoitteena on käyttää mikrovesikkeleitä diagnostisina sekä terapeuttisina työkaluina. Tätä varten MV:en toiminnallisia mekanismeja pitäisi ymmärtää paremmin sekä kehittää ja standardoida luotettavat menetelmät niiden kvantifiointiin ja karakterisointiin. Tutkimuksen tavoitteena oli 1) määrittää erilaisten aktivaatioiden vaikutusta verihiutaleista tuotetun MV-alapopulaatioiden ominaisuuksiin, 2) pystyttää laboratorioon MV:en kvantifiointiin rikin, fosfaatin ja vanilliinin reaktioon perustuva kokonaislipidimääritysmenetelmä (SPV) ja 3) tutkia trombiini- ja proteinaasi-inhibiittoreiden vaikutusta verihiutaleiden MV-muodostukseen. Verihiutaleet eristettiin terveiltä vapaaehtoisilta luovuttajilta saadusta verestä ja MV:tä tuotettiin aktivoimalla verihiutaleet trombogeenisesti (trombiini ja kollageeni, TC), patofysiologisesti (lipopolysakkaridi, LPS) ja kalsium-ionoforilla (A23187, positiivinen MV-muodostuksen kontrolli). Tuotettu MV:n määrä sekä kokojakauma mitattiin nanopartikkeleiden jäljitysanalyysin (NTA) avulla. MV:t karakterisoitiin bikinkoniinihapon reaktioon perustuvalla menetelmällä (BCA) sekä SPV-menetelmällä. MV-tuottoa inhiboitiin trombiini-proteinaasi-inhibiittori PPACK:lla, jonka vaikutusmekanismia selvitettiin vertaamalla hirudiinin ja hepariinin (trombiini-inhibiittoreita) sekä Complete:n (proteinaasi-inhibiittorivalmiste) vaikutusta mikrovesikkeleiden muodostumiseen. Mikrovesikkeleissä havaittiin aktivaatiokohtainen muutos lipidi- ja proteiinisisällössä. Ionofori-indusoitujen MV:en määrä oli suurin, mutta niiden sisältämä lipidi- ja proteiinimäärä oli vain murto-osa TC- ja LPS-indusoituihin MV:hin verrattuna. Verihiutaleiden merkittävimmistä fysiologisista aktivaatioista vain TC-indusoitujen MV:en määrä oli korkeampi kontrollialtistukseen verrattuna. Vesikkelimuodostuksessa havaittiin PPACK-inhibiittorivälitteinen väheneminen, jonka vaikutus oli mahdollisesti proteinaasi-inhibiittorivälitteinen, mutta ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä. Lisäksi eristetyt MV-alapopulaatiot erosivat toisistaan merkittävästi vesikkelikohtaisen lipidimäärän suhteen. Lisäksi tutkimuksessa osoitettiin, että käytetyillä jaottelusentrifugointiohjelmilla ei MV-alapopulaatioita voitu eristää luotettavasti. Lisäksi näytteen laimennos vaikutti MV:en kvantifiointiin NTA:ssa. SPV-menetelmän havaittiin reagoivan eri intensiteetillä eri lipidien kanssa, mikä yhdessä aktivaatio- sekä vesikkelipopulaatiokohtaisen lipidikoostumuksen erojen kanssa haittasi MV:en kvantifiointia kokonaislipidimäärän perusteella. Tutkimuksen aikana tehtyjen analyysien pohjalta ei voitu tehdä tilastollisesti merkittäviä havaintoja johtuen yksilöiden välisistä suurista eroista. Vesikulaation inhibitiokokeita tulisi jatkaa, jotta PPACK-inhibiittorin vaikutus vesikkelimuodostuksen estoon ja sen mekanismit voidaan selvittää. Vesikkelitutkimuksessa tulee tehdä vielä paljon metrologista kehitystä eri eristys- ja tutkimusmenetelmien optimoinnissa, jotta MV:en (pato)fysiologisia ominaisuuksia ja toiminnallisia vaikutuksia voidaan tutkia luotettavasti.