Skip to main content
Login | Suomeksi | På svenska | In English

Ubiquitin-specific protease 14 in Huntington's disease

Show full item record

Title: Ubiquitin-specific protease 14 in Huntington's disease
Author(s): Ahvenainen, Terhi
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences, Department of Biosciences
Discipline: Genetics
Language: English
Acceptance year: 2015
Abstract:
Huntington's disease (HD) is a progressive neurodegenerative disorder that causes involuntary muscle movements, deteriorates muscle coordination and cognitive decline. Typical onset age of the disease is in mid age, although a juvenile form of HD is also known. The disease is inherited in an autosomal dominant manner via a mutation in the huntingtin gene (HTT). The characteristic mutation in HTT is an expansion of the glutamine stretch at the 5 end of the gene. Excessive amounts of glutamine residues alters the conformation and chemical features of the huntingtin protein (HTT) leading to accumulation of cellular aggregates. Although to date there are several known alterations in the cell that contribute to the disease, the pathogenesis of HD is not fully understood. Ubiquitin proteasome system (UPS) dismantles proteolytically unneeded or damaged proteins, which are targeted to proteolysis when ubiquitin tags are added to them. Deubiquitinating enzymes (DUB) recycle ubiquitin molecules by releasing them from proteasome substrates. Recycling of ubiquitin is critical to a cell as it maintains the free pool of the targeting molecule. Ubiquitin-specific protease 14 (USP14) is one of the DUB family enzymes and its distinctive function is to remove ubiquitin molecules from the tip of the ubiquitin chain and thus antagonize protein degradation. Although the specific function of the protein is unclear, it seems that USP14 operates as a fine regulator of protein turnover rate and in ER stress both in catalytic and non catalytic manner. The role of USP14 is especially emphasized in the nervous system, as it regulates synaptic transmission and neuronal development. Although it is suggested that dysfunction of UPS is involved in the pathogenesis of HD, the role of USP14 in the disease remains to be unknown. IU1 is a novel inhibitor of the catalytic domain of USP14. Studies with IU1 indicate that inhibition of USP14 enhances the clearance of aggregate prone proteins. The approach of this thesis was aimed to elucidate the routes of HD pathogenesis from diverse approaches. The general aim of the thesis was to investigate the role of USP14 in the wild-type PC6.3 cell model, and in the pathogenesis of HD by expressing HTT proteins with different lengths of glutamine stretches in PC6.3 cells. The specific aim of the study was to examine by western blot and microscopy analysis the pathogenic routes of HD that involve ER stress, oxidative stress, autophagy and mutant HTT aggregate dynamics. The function of USP14 was studied with overexpression of USP14, or by inhibiting its catalytic activity by IU1. The findings of this thesis show that overexpression of USP14 enhances the clearance of mutant HTT aggregates, and this effect is obtained in catalytic activity dependent manner. I show that upregulated USP14 is connected to improved clearance of mutant HTT and inhibition of autophagy, suggesting that the degradation is mediated via UPS. The catalytic activity of USP14 might also be important in ER stress regulation, as the results indicate that IU1 activates phosphorylation of both JNK and eIF2α. I was also able to establish a connection between USP14 and GADD34, as I show that GADD34 upregulates USP14. Finally, I show that catalytic inhibition of USP14 decreases the expression of antioxidant SOD2. The data in this thesis is lacking statistical significance, and it can be considered solely as a guideline. However, together these results indicate that the deubiquitinating activity of USP14 increases survival in PC6.3 cells in both a healthy and a HD model.
Huntingtonin tauti (HD) on progressiivinen hermostorappeumatauti, joka aiheuttaa pakkoliikkeitä, lihaskoordinaation rappeutumista sekä kognition heikkenemistä. Vaikka tyypillisesti oireet alkavat keski iässä, Huntingtonin taudista tunnetaan myös nuoruudessa puhkeava muoto. Tautia aiheuttava mutaatio huntingtiini geenissä (HTT) periytyy vallitsevasti kromosomissa 4. HTT-geenin 5 päässä oleva mutaatio aiheuttaa CAG toistojakson monistuman. Mutaatio muuttaa huntingtiini proteiinin (HTT) laskostumista sekä kemiallisia ominaisuuksia, mikä johtaa solun sisäisten HTT-aggregaattien kerääntymiseen. Vaikka tiedetään, että Huntingtonin tautiin liittyvät useat solun sisäiset muutokset, sen syntymekanismia ei tarkalleen tunneta. Ubikitiini proteasomi systeemi (UPS) hajottaa solussa proteolyyttisesti tarpeettomia tai vaurioituneita proteiineja, jotka on kohdennettu systeemiin ubikitiinimolekyyleillä. Ubikitiinia poistavat entsyymit (DUB) irrottavat ubikitiinia proteiinisubstraateista ja vapauttavat sen solulimaan. Ubikitiinin kierrätys on tärkeä prosessi solun aineenvaihdunnassa, sillä se ylläpitää vapaan ubikiitinin määrää. Ubikitiinille spesifinen proteaasi 14 (USP14) kuuluu DUB proteiiniperheeseen ja poistaa ketjuuntunutta ubikitiinia sen distaalisesta päästä yksi kerrallaan hidastaen proteolyysiä. Vaikka tiedetään, että USP14 toimii proteiinien hajotuksen hienosäätelijänä sekä katalyyttisesti että ei katalyyttisesti, sen tarkkaa mekanismia ei vielä tunneta. On myös osoitettu, että USP14 estää ER-stressiä katalyyttisen ja ei katalyyttisen mekanismin avulla. Tiedetään, että USP14-proteiinilla on tärkeä rooli hermostossa, sillä se säätelee synaptista välitystä ja hermoston kehittymistä. USP14-proteiinin roolia ei ole tutkittu Huntingtonin taudissa, vaikka oletetaan, että UPS:n toimintahäiriöt liittyvät taudin patogeneesiin. IU1 on uusi USP14 proteiinin katalyyttisen alayksikön estäjä. Tutkimukset ovat osoittaneet, että USP14 proteiinin katalyyttinen estäminen IU1-molekyylillä tehostaa proteiiniaggregaattien hajottamista solussa. Tämän Pro gradu tutkielman ja siihen liittyvien kokeiden tavoitteena oli tutkia Huntingtonin taudin patogeneesiä useista eri lähtökohdista. Yleinen tavoite oli tutkia tautia USP14 proteiinin viitekehyksestä sekä villityypin PC6.3 soluilla että HD mallin soluilla, joissa ilmennettiin eripituisia CAG toistojaksoja huntingtiini plasmidien avulla. Pro gradu -tutkielmassa keskityttiin erityisesti tutkimaan Huntingtonin taudin patogeneettisistä reiteistä ER stressiä, oksidatiivista stressiä, autofagiaa ja mutantti HTT proteiinin aggregaattidynamiikkaa. Menetelminä käytettiin western blot menetelmää ja mikroskooppianalyysiä. USP14-proteiinin toimintaa tutkittiin yli ilmentämisellä tai estämällä sen katalyyttinen aktiivisuus IU1-molekyylillä. Tutkielmassa olevat löydöt osoittavat, että USP14-proteiinin yli ilmentäminen tehostaa mutantti HTT proteiinin hävittämistä solusta mekanismilla, joka on riippuvainen katalyyttisestä aktiivisuudesta. Korkeampi USP14 proteiinin määrä on yhteydessä sekä tehostuneeseen mutantti-HTT proteiinin hajoitukseen että autofagian estämiseen. Tämä viittaa siihen, että mutantti-HTT-proteiinin vähentyminen on kytkeytynyt UPS:iin. Tutkielmassani näytän myös, että USP14-proteiinin katalyyttinen aktiivisuus voi olla tärkeä ER-stressin säätelyssä, sillä IU1 aktivoi ER-stressiproteiinien JNK ja eIF2α fosforylaatiota. Tulokseni osoittavat lisäksi, että GADD34 yli ilmentäminen PC6.3-soluissa lisää USP14-proteiinin määrä. On mahdollista, että USP14 vaikuttaa myös antioksidanttitasolla solussa, sillä tulosteni perusteella USP14-proteiinin katalyyttinen estäminen vähentää SOD2 proteiinin ilmentymistä. Tutkielmassa esitetyistä tuloksista puuttuu tilastollista varmuutta ja niitä voidaan pitää lähinnä suuntaa antavina. Yhdessä nämä tulokset kuitenkin osoittavat, että USP14-proteiinin ubikitiinia poistava aktiivisuus lisää solun selviytymismahdollisuuksia sekä terveessä solussa että HD solumallissa.


Files in this item

Files Size Format View
ubiquiti.pdf 8.682Mb PDF

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record