Cell models for studying the interplay between conjugative metabolism and efflux transporters : establishing UGT1A1, UGT2B7 and MRP3 transfected MDCK cell lines
| Title: | Cell models for studying the interplay between conjugative metabolism and efflux transporters : establishing UGT1A1, UGT2B7 and MRP3 transfected MDCK cell lines |
| Author(s): | Järvinen, Erkka |
| Contributor: | University of Helsinki, Faculty of Pharmacy |
| Discipline: | Pharmaceutical Chemistry |
| Language: | English |
| Acceptance year: | 2016 |
| Abstract: |
UDP-glucuronosyltransferases (UGTs) catalyse glucuronidation reactions between glucuronic acid and drug molecules, which contain nucleophilic groups, mostly hydroxyls, amines or carboxylic acids. Glucuronidation is the most important reaction in the conjugative drug metabolism. Because these conjugates are not usually able to cross cell membranes passively, they need active efflux transport. Efflux transporters mostly belong to superfamily of ATP-binding cassette transporters (ABC). Subfamily C of ABC transporters (ABCC) are known to be involved in efflux transport of glucuronides. Especially MRP2 (ABCC2) and MRP3 (ABCC3) play key roles in the elimination of glucuronide conjugates of drugs. MRP2 is localized in the apical membranes of hepatocytes and enterocytes, whereas MRP3 is localized in the basolateral membranes of the respective cells. On the other hand, UGT1A1 and UGT2B7 are highly expressed in liver and small intestine and are the most important UGTs in drug metabolism. It is known, that UGTs and efflux transporters work together forming interplay to eliminate drugs. Therefore, studying both of them in the same in vitro system is in important focus of drug metabolism studies.
The Madin Darby canine kidney cell line (MDCK) is one of the standard in vitro tools in drug metabolism studies. In this study, MDCK was chosen for a cell line to co-express UGTs (UGT1A1 or UGT2B7) and efflux transporters (MRP2 and MRP3 simultaneously. Therefore, cloning of the UGT2B7 cDNA and the ABCC3 cDNA encoding MRP3 was aimed in this study. On the other hand, the UGT1A1 cDNA was already cloned in-house and MRP2 expressing MDCK cells were established earlier.
Cloning of the UGT2B7 cDNA was not successful in this study despite of several different strategies such as PCR-amplification of the cDNA fragment using kidney or liver sscDNA as template. Cloning of the ABCC3 cDNA encoding MRP3 was achieved and a mammalian expression vector containing this cDNA was constructed. In addition, the mammalian expression vector containing the UGT1A1 cDNA was used to establish MDCK-UGT1A1 cells and this cell line was characterized regarding the expression of UGT1A1 mRNA and UGT1A1 protein amount. Furthermore, establishment of MDCK-UGT1A1-MRP2 cell line was attempted in this study without success.
The mammalian expression vector containing the ABCC3 cDNA encoding MRP3 could be used for future experiments to achieve novel cell lines such as MDCK-UGT1A1-MRP3 and MDCK-UGT1A1-MRP2-MRP3 for drug metabolism studies. In addition, the novel cell line MDCK-UGT1A1 could be used for drug metabolism studies in further experiments, but also as a cell line for further establishment of above cell lines. On the other hand, the cloning of the UGT2B7 cDNA needs optimization and several different strategies should be used to achieve the mammalian expression vector containing this cDNA.
UDP-glukuronosyylitransferaasit (UGT:t) katalysoivat glukuronidaatioreaktiota, jossa glukuronidihappo liittyy lääkeaineiden nukleofiilisiin ryhmiin kuten hydroksyyleihin, amiineihin tai karboksyylihappoihin. Glukuronidaatio on kaikkein tärkein metaboliareaktio konjugatiivisessa lääkeainemetaboliassa. Glukuronidikonjugaatit eivät pysty pääsääntöisesti läpäisemään solukalvoja passiivisesti, joten ne täytyy kuljettaa aktiivisesti ulos soluista. Efflux-transportterit vastaavat yhdisteiden aktiivisesta kuljetuksesta ulos soluista. Suurin osa efflux-transporttereista kuuluu adenosiinitrifosfaattia (ATP) sitovien efflux-transportterien perheeseen (ABC), joista etenkin C-alaperhe (ABCC) osallistuu glukuronidikonjugaattien kuljetukseen ulos soluista. MRP2 (ABCC2) ja MRP3 (ABCC3) ovat tärkeässä asemassa tässä kuljetuksessa. MRP2 on lokalisoitunut hepatosyyttien ja enterosyyttien apikaalimembraanille, kun taas MRP3 on lokalisoitunut vastaavien solujen basolateraalimembraanille. Lisäksi UGT1A1 ja UGT2B7 ekspressoituvat suuressa määrin maksassa ja ohutsuolessa, ja ovat täten kaikkein tärkeimpiä UGT-entsyymejä lääkeainemetaboliassa. Tiedetään, että UGT:t ja efflux-transportterit osallistuvat yhdessä lääkeaineiden eliminaatioon ja muodostavat täten yhteispelin. Tämän takia on tärkeää tutkia kumpaakin prosessia samassa in vitro mallissa.
Madin Darby koiran munuaissolulinja (MDCK) on yksi perustyökaluista lääkeainemetaboliatutkimuksissa. Tässä tutkimuksessa MDCK-solut valittiin solulinjaksi, jossa ekspressoidaan samanaikaisesti UGT:t (UGT1A1 tai UGT2B7) sekä MRP:t (MRP2 ja MRP3). Tätä varten tämän tutkimuksen tavoite oli kloonata UGT2B7:n ja ABCC3:n, joka koodaa MRP3:a, cDNA:t. Toisaalta, UGT1A1:n cDNA oli kloonattu ja MRP2:ta ekspressoivat MDCK-solut oli muodostettu jo aikaisemmin tässä laboratoriossa.
UGT2B7:n cDNA:n kloonaus ei onnistunut tässä tutkimuksessa, vaikka useita eri strategioita yritettiin, kuten cDNA fragmentin PCR-amplifikaatiota maksa- ja munuais-sscDNA:sta. Toisaalta, ABCC3:n cDNA, joka koodaa MRP3:a, saatiin kloonattua ja nisäkäsekspressiovektori, joka sisältää tämän cDNA:n, saatiin muodostettua. Lisäksi nisäkäsekspressiovektoria, joka sisältää UGT1A1 cDNA:n, käytettiin muodostamaan MDCK-UGT1A1 solulinja, jonka UGT1A1 mRNA-ekspressio ja proteeniekspressio karakterisoitiin. Toisaalta, MDCK-UGT1A1-MRP2 solulinjaa ei saatu muodostettua yrityksistä huolimatta.
ABCC3:n cDNA:n, joka koodaa MRP3:a, sisältämää ekspressiovektoria voidaan käyttää tulevaisuudessa eri MDCK solulinjojen transfektointiin, jotta saataisiin muodostettua esimerkiksi MDCK-UGT1A1-MRP3 ja MDCK-UGT1A1-MRP2-MRP3 solulinjat lääkeainemetaboliatutkimusta varten. Lisäksi tässä tutkimuksessa muodostettua uutta MDCK-UGT1A1 solulinjaa voidaan käyttää tulevaisuudessa lääkeainemetaboliatutkimuksessa, mutta myös yllämainittujen solulinjojen muodostamiseen. Toisaalta, UGT2B7:n cDNA:n kloonaus vaatii lisää optimisaatiota.
|
| Keyword(s): | UGT1A1 UGT2B7 MRP2 MRP3 MDCK interplay glucuronidation efflux transport glukuronidisaatio yhteispeli efflux-kuljetus |
Files in this item
| Files | Size | Format | View |
|---|---|---|---|
| Erkka_jarvinen_masters_thesis.pdf | 2.407Mb |
This item appears in the following Collection(s)
-
Faculty of Pharmacy [577]