Skip to main content
Login | Suomeksi | På svenska | In English

Luminoivien bakteerikantojen käyttö antimikrobiseulonnassa

Show full item record

Title: Luminoivien bakteerikantojen käyttö antimikrobiseulonnassa
Author(s): Kenttä, Laura
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Pharmacy
Discipline: Pharmacological biology
Language: Finnish
Acceptance year: 2015
Abstract:
Susceptibility to antibiotics is constantly developing in bacteria due to selection pressure caused by use of antibiotics. For this reason, finding new antimicrobial substances is imperative. High-throughput screening (HTS) is an important tool to find new active substances. The need to analyse as many substances in as small time as possible is emphasised in modern drug development. Robust methods, suitable for fast throughput of substances, miniaturisation and automation, are particularly useful. In the context of antimicrobial screening, methods utilising bioluminescence can correspond this need, and genetic engineering can help in developing bacterial strains with beneficial features for screening. In this work, two screening methods were developed and optimised using genetically engineered Escherichia coli strains. The screening methods make use of the bioluminescent properties of the strains, and the methods can be used to screen compound libraries for antimicrobials rapidly enough to approach HTS. The strain E. coli WZM120/pCGLS 11 is constitutively luminescent, so weakening of luminescence means the cell viability weakens. The strain E. coli K12/pCSS305, where luminescence is produced by a heat-inducible runaway plasmid, can be used to especially detect compounds inhibiting DNA replication. In developing the method, workflow was optimised and conditions were validated so as to enable possible HTS campaigns. The target was to create as simple, fast and reproducible a method as possible. The Z' values calculated in assessing the performance are excellent for a cell-based method. The signal is readily distinguishable, the bacterial strains are in a stable manner, and the method is well reproducible. It is possible to continue assay development from 96-well format to 384-well format.
Antibioottien käytön aiheuttaman valintapaineen seurauksena mikrobien resistenssi antibiootteja kohtaan kehittyy jatkuvasti, minkä vuoksi uusien antimikrobiyhdisteiden löytäminen on välttämätöntä. Tehoseulonta (high-throughput screening, HTS) on nykyaikaisessa lääkekehityksessä tärkeä tapa löytää uusia biologisesti aktiivisia yhdisteitä. Nykyaikana lääkekehityksessä korostuu tarve analysoida mahdollisimman paljon yhdisteitä mahdollisimman lyhyessä ajassa. Nopeaan yhdisteiden läpisyöttöön soveltuvat karkeat menetelmät, joita voidaan miniatyrisoida ja automatisoida, ovat tällöin hyödyllisiä. Antimikrobiseulonnan osalta bioluminesenssia hyödyntävät menetelmät voivat vastata näihin tarpeisiin, ja geenitekniikkaa voidaan käyttää apuna luomaan bakteerikantoja, joilla on seulonnassa hyödyllisiä ominaisuuksia. Työssä kehitettiin ja optimoitiin kaksi seulontamenetelmää, joissa käytetään muuntogeenisiä Escherichia coli -bakteerikantoja. Menetelmät hyödyntävät näiden bakteerikantojen bioluminesenssiominaisuuksia, ja niiden avulla voidaan jatkossa seuloa yhdistekirjastoista antimikrobisia yhdisteitä käsittelynopeudella, joka lähestyy tehoseulontamenetelmää. E. coli WZM120/pCGLS 11 -kanta on konstitutiivisesti luminoiva, joten sen luminesenssin heikkeneminen kertoo bakteerin elinvoimaisuuden heikkenemisestä. E. coli K12/pCSS305 -kantaa, jossa luminesenssia tuottaa lämpöaktivoituva runaway-plasmidi, voidaan käyttää havaitsemaan erityisesti DNA-replikaatiota estäviä yhdisteitä. Menetelmänkehityksessä työtavat optimoitiin ja kasvatusvaiheet validoitiin HTS-kampanjan mahdollisuutta varten. Tarkoitus oli saada aikaan mahdollisimman yksinkertainen, nopea ja toistettava menetelmä. Menetelmien validoinnissa lasketut Z'-arvot ovat solupohjaiselle menetelmälle erinomaisia. Signaali erottuu selkeästi ja menetelmä on hyvin toistettavissa. Jatkokehitystä 96-kuoppalevyformaatista 384-formaattiin on mahdollista selvittää.
Keyword(s): E. Coli bioluminescence screening antimicrobials drug development protocol development bioluminesenssi seulonta antimikrobiyhdisteet lääkekehitys menetelmänkehitys


Files in this item

Files Size Format View
pro_gradu_Kentta_Laura_2015.pdf 422.9Kb PDF

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record