Käärmeistä ja merietanoista eristettyjen toksiinien farmakologiset ja terapeuttiset vaikutukset neuronaalisiin nikotiinireseptoreihin
| Title: | Käärmeistä ja merietanoista eristettyjen toksiinien farmakologiset ja terapeuttiset vaikutukset neuronaalisiin nikotiinireseptoreihin |
| Author(s): | Salmelainen, Laura |
| Contributor: | University of Helsinki, Faculty of Pharmacy |
| Discipline: | Pharmacology and toxicology |
| Language: | Finnish |
| Acceptance year: | 2010 |
| Abstract: |
Neuronal nicotinic acetylcholine receptors are ligand-gated ion channel receptors that consist of five transmembral receptor subunits. They can form a functional receptor subtype solely out of alfa-subunits or out of a combination of alfa- and beta-subunits. The number of potential assembly of nicotinic receptor subunits is high because at least nine alfa-subunits (α2-α10) and three beta-subunits (β2-β4) have been recognized. The composition, location and pharmacological properties of different subtypes have not yet been fully characterized. However, it has been shown that the neuronal nicotinic receptors are involved in a wide range of physiological and pathofysiological processes especially in the central nervous system. Toxins from snakes and Conus -sea snails have proved to be important tools in neuropharmacological research, from which considerable information on structure and subunit combinations of the nicotinic receptors have been received. Receptors binding assays or autoradiographic experiments exploiting toxins have also been useful methods to locate the neuronal nicotinic receptors in mammalian brain. The aim of the experimental part of the Pro gradu was to characterize in vitro binding affinities of α-contoxin MII, α-conotoxin Vc1.1, neurotoxin II, α-cobratoxin and weak-toxin synthetized in Moscow and of well-known receptor ligands cytisine and methyllycaconitine to neuronal nicotinic receptors in SH-SY5Y- and SH-EP1-hα7-cell membrane preparations. SH-SY5Y-cells are known to express various neuronal receptor subtypes (α3* or α7) endogenously. For the SH-EP1-hα7-cells part, the cell line has been transfected with α7 nAChR-genes and it expresses only α7 receptor subtypes. Receptor competition studies were performed with [3H]-epibatidine (400 pM SH-SY5Y, 2000 pM SH-EP1-hα7) and the radioactivity was measured with a Microbeta- scintillation counter. [3H]-epibatidine was perceived to be displaced almost completely by cytisine and methyllycaconitine in both cell lines. In addition to this, the toxins were shown to bind to two distinct receptor-binding sites in SH-SY5Y-cells. Also α-contoxin MII and α-conotoxin Vc1.1 inhibited [3H]-epibatidine binding by biphasic manner, but the maximal displacement failed to be complete. From α-conotoxins only MII had affinity to α7 receptors in SH-EP1-hα7-cells. Neurotoxin II, α-cobratoxin and weak-toxin were not found to compete with [3H]-epibatidine for the same binding sites in SH-SY5Y-cells. The results confirm the assumption that cytisine and methyllycaconitine label various nAChR-subtypes. Instead, based on SH-SY5Y-cell assays α-conotoxins used in this study would seem to label spesifically only particular nAChR-subtypes. The receptor competition studies also confirm the prevalent conception that neurotoxin II, α-cobratoxin and weak-toxin do not bind to neuronal nicotinic receptor subtypes containing α3-subunits.
Neuronaaliset asetyylikoliinin nikotiinireseptorit (nAChR) ovat ligandivälitteisiä ionikanavareseptoreita, jotka koostuvat viidestä solukalvonläpäisevästä alayksiköstä. Ne voivat muodostaa toiminnallisen reseptorialatyypin pelkästään alfa-alayksiköistä tai alfa- ja beta-alayksiköiden yhdistelmästä. Mahdollisia neuronaalisia nikotiinireseptorialatyyppejä on lukuisia, koska ainakin yhdeksän alfa-alayksikköä (α2-α10) ja neljä beta-alayksikköä (β2-β4) on pystytty tunnistamaan. Eri alatyyppien koostumuksia, sijaintia ja farmakologisia ominaisuuksia ei kaikkia vielä täysin tunneta. Neuronaalisten nikotiinireseptorien on katsottu kuitenkin osallistuvan laajalti elimistön fysiologisiin toimintoihin sekä eri patofysiologisiin tiloihin erityisesti keskushermostossa. Käärmeistä ja Conus-suvun merietanoista eristetyt toksiinit ovat osoittautuneet tärkeiksi työvälineiksi neurofarmakologisissa tutkimuksissa, joista on saatu merkittävää lisätietoa neuronaalisten nikotiinireseptoreiden rakenteesta ja eri alatyyppien alayksikkökoostumuksista. Toksiineja hyödyntävillä reseptorisitoutumiskokeilla ja autoradiografisilla tutkimuksilla on voitu myös paikantaa reseptoreita nisäkkäiden aivoissa. Pro gradun erikoistyön tarkoituksena oli karakterisoida Moskovassa syntetisoitujen α-konotoksiini MII:n, α-konotoksiini Vc1.1:n, neurotoksiini II:n, α-kobratoksiinin ja weak-toksiinin sekä tunnettujen nikotiinireseptoriligandien sytisiinin ja metyylilykakonitiinin sitoutumistaipumuksia in vitro SH-SY5Y- sekä SH-EP1-hα7-solukalvopreparaattien neuronaalisiin nikotiinireseptoreihin. SH-SY5Y-solujen tiedetään ilmentävän endogeenisesti useita eri neuronaalisia nAChR-alatyyppejä (α3* tai α7). SH-EP1-hα7-soluihin on puolestaan transfektoitu α7 nAChR-geeni ja ne ilmentävät vain α7 nAChR-alatyyppejä. Reseptorisyrjäytymiskokeet suoritettiin [3H]-epibatidiinilla (400 pM SH-SY5Y, 2000 pM SH-EP1-hα7) ja radioaktiivisuus mitattiin Microbeta-tuikenestelaskurilla. [3H]-epibatidiinin havaittiin syrjäytyvän lähes täydellisesti sytisiinilla ja metyylilykakonitiinilla molemmilla tutkituilla solulinjoilla. Tämän lisäksi toksiinien osoitettiin sitoutuvan kahteen reseptorisitoutumispaikkaan SH-SY5Y-soluilla. Myös α-konotoksiini MII:n ja α-konotoksiini Vc1.1:n kilpailu [3H]-epibatidiinin sitoutumisessa SH-SY5Y-soluilla noudatti kaksijakoisuuttaa, mutta radioligandin kokonaissyrjäytyminen jäi kuitenkin vain osittaiseksi. α-Konotoksiineista vain MII:lla havaittiin affiniteettia α7 reseptoreihin SH-EP1-hα7-soluilla. Neurotoksiini II:n, α-kobratoksiinin ja weak-toksiinin ei havaittu kilpailevan SH-SY5Y-soluilla samoista sitoutumispaikoista [3H]-epibatidiinin kanssa. Tulokset antavat vahvistusta sille, että sytisiini ja metyylilykakonitiini leimaavat useita eri nAChR-alatyyppejä. Sen sijaan SH-SY5Y-solukokeiden perusteella tutkitut α-konotoksiinit näyttäisivät leimaavan spesifisti vain tiettyjä nAChR-alatyyppejä. Syrjäytymiskokeet vahvistavat myös yleistä käsitystä siitä, ettei neurotoksiini II:n α-kobratoksiinin tai weak-toksiinin spesifinen sitoutuminen tapahdu ainakaan neuronaalisiin α3-alayksikköä sisältäviin nAChR-alatyyppeihin.
|
| Keyword(s): | SH-SY5Y SH-EP1-hα7 nicotinic acetylcholine receptors α-bungarotoxin α-conotoxin MII receptor binding [3H]-epibatidine asetyylikoliinin nikotiinireseptori α-bungarotoksiini α-konotoksiini MII reseptorisitoutuminen [3H]-epibatidiini |
Files in this item
| Files | Size | Format | View |
|---|---|---|---|
| Salmelainen.pdf | 2.078Mb |
This item appears in the following Collection(s)
-
Faculty of Pharmacy [577]