Nanonestekromatografia-mikrosirusähkösumutus-tandemmassaspektrometria-menetelmän
| Title: | Nanonestekromatografia-mikrosirusähkösumutus-tandemmassaspektrometria-menetelmän |
| Author(s): | Saarelainen, Taija |
| Contributor: | University of Helsinki, Faculty of Pharmacy |
| Discipline: | Pharmaceutical Chemistry |
| Language: | Finnish |
| Acceptance year: | 2010 |
| Abstract: |
Steroid hormones are involved in many physiological functions such as stress response and the maintenance of salt-water balance and pregnancy. Concentrations of steroids in the body fluids are generally very low (below ng/ml). Steroid hormones are metabolically associated and changes in mutual concentration levels of different steroids may signify a disease. Methods that allow the measurement of various steroids simultaneously are of great importance in investigating the role of steroid metabolism for example in formation of cancer. The aim of this work was to develop a sensitive and selective method for simultaneous quantification of 16 steroids in plasma. Nano liguid chromatography-microchip electrospray ionization-tandem mass spectrometry (nanoLC-µESI-MS/MS) was used in order to achieve good sensitivity. C18 enrichment column and separation column, and an electrospray tip were integrated onto the chip that was used in this work. Mass spectrometric parameters were optimized by using a MS calibration and diagnostic chip. It was noticed that the structure of steroids plays an important role on how the compound behave in electrospray ionization. Steroids with 4,5-ene-3-one-structure had much lower limits of detection than steroids without conjugated double bonds (0,075-0,5 ng/ml and 5-25 ng/ml respectively). The chosen sample pretreatment method to extract the steroids from plasma did not work properly, because it was able to extract only a third of the compound's real concentration. Analysis of some compounds was also difficult because of the background noise coming from plasma. The method development was therefore decided to continue with eight steroids that were well detectable and had 4,5-ene-3-one-structure. The limits of detection were 0,075-0,5 ng/ml in biological matrix for these compounds. Eight knock out and seven wild type mouse plasma samples were analyzed using the validated method. The method was able to quantify aldosterone, corticosterone and androstenedione. Developed method did not meet all the aims of this work. Derivatizated compounds, different equipment or totally new method should be used in order to accomplish the aims.
Steroidihormonit osallistuvat moniin elintoimintoihin, kuten stressin sietoon sekä suola-vesitasapainon ja raskauden ylläpitoon. Niiden pitoisuudet elimistössä ovat yleensä erittäin alhaiset (alle ng/ml). Steroidihormonien biosynteesit ovat toisiinsa kytkettyjä ja muutokset keskinäisissä pitoisuussuhteissa voivat olla merkki sairaudesta. Analyysimenetelmillä, joilla voidaan samanaikaisesti määrittää usean eri steroidin pitoisuus, on tärkeä rooli steroidimetabolian osuuden selvittämisessä muun muassa syövän synnyssä. Erikoistyön tavoitteena oli kehittää herkkä ja selektiivinen kvantitointimenetelmä 16 erilaisen steroidin samanaikaiseen määrittämiseen plasmasta. Jotta saavutettaisiin hyvä herkkyys, päädyttiin käyttämään nanonestekromatografia-mikrosirusähkösumutus-tandemmassaspektrometria-menetelmää (nanoLC-µESI-MS/MS). Tutkimuksessa käytettiin mikrosirua, johon oli integroitu C18-faasin esikolonni ja erotuskolonni sekä sähkösumutuskärki. Massaspektrometristen parametrien optimointiin käytettiin erillistä optimointimikrosirua. Tutkimuksessa havaittiin, että steroidin rakenne vaikuttaa merkittävästi yhdisteen käyttäytymiseen sähkösumutuksessa. 4,5-eeni-3-oni-rakenteellisten steroidien havaintoalarajat puhdasaineseoksessa olivat huomattavasti paremmat kuin steroidien, joiden rakenteessa ei ole konjugoituneita kaksoissidoksia (0,075-0,5 ng/ml ja 5-25 ng/ml vastaavasti). Valittu esikäsittelymenetelmä steroidien erottamiseksi plasmasta ei ollut hyvä, koska sillä pystyttiin uuttamaan vain noin kolmasosa yhdisteen todellisesta pitoisuudesta. Lisäksi plasmasta tullut taustakohina vaikeutti joidenkin yhdisteiden analysointia. Tämän seurauksena menetelmän kehittämistä jatkettiin kahdeksalla hyvin detektoitavalla 4,5-eeni-3-oni-rakenteellisella steroidilla. Havaintoalarajat näille yhdisteille biologisessa matriisissa olivat 0,075-0,5 ng/ml. Validoidulla menetelmällä analysoitiin kahdeksan geneettisesti muunnellun ja seitsemän villin-tyypin hiiren plasmanäytettä. Menetelmällä pystyttiin määrittämään aldosteronin, kortikosteronin ja androsteenidionin pitoisuudet. Kehitetty menetelmä ei täyttänyt kaikkia asetettuja tavoitteita. Jotta tavoitteeseen päästäisiin, täytyisi siirtyä käyttämään derivatisoituja yhdisteitä, vaihtaa laitteistoa tai kehittää kokonaan uusi kromatografiamenetelmä.
|
| Keyword(s): | steroids microchip Nano liquid chromatography mass spectrometry electrospray ionization plasma mikrosiru nanonestekromatografia massaspektrometria sähkösumutus plasma steroidit |
Files in this item
| Files | Size | Format | View |
|---|---|---|---|
| Taija_ProGradu_digitalVersio.pdf | 417.2Kb |
This item appears in the following Collection(s)
-
Faculty of Pharmacy [524]