Evaluation of the Stability of Cytochrome P450 immobilized enzyme microreactors
| Title: | Evaluation of the Stability of Cytochrome P450 immobilized enzyme microreactors |
| Author(s): | Pihlaja, Tea |
| Contributor: | University of Helsinki, Faculty of Pharmacy |
| Discipline: | Pharmaceutical Chemistry |
| Language: | English |
| Acceptance year: | 2017 |
| Abstract: |
Cytochrome P450 (CYP) enzymes are important catalysers in the first phase of drug metabolism. Roughly two thirds of drugs are oxidized via CYP enzymes, which enable the further modification of drugs, and their excretion. In this thesis, human liver microsomes containing the main hepatic CYP enzymes were immobilized on thiol-ene based micropillar arrays and their stability was evaluated using a CYP2C9 isoenzyme specific luminescent substrate, Luciferin-H. The aim of the study was to develop microfluidic immobilized enzyme reactors (IMERs) for studying enzyme kinetics and drug-drug interactions. For this purpose, the instability issues associated with previously reported CYP-IMERs were carefully addressed.
The CYP immobilization protocol used was based on a protocol previously developed in the context of other research projects and relied on biotinylation of human liver microsomes (HLM) with help of fusogenic liposomes. The biotinylated HLMs were then attached to the streptavidin-modified thiol-ene surfaces. The CYP activity was determined by utilizing microfluidics under continuous flow conditions (typically 5 μL/min) in the presence of NADPH. The luminescent metabolite formed by the CYP2C9 enzymes was quantified with a commercial well-plate reader from fractions collected at the microreactor outlet. Half-life was used to compare the differences between enzyme stabilities reached via different immobilization conditions. The effects of flow rate and reaction temperature on the stability of the CYP-IMERs was evaluated together with addition of antioxidative agents and reactive oxygen species (ROS) scavengers. Different functionalization steps as well as storage time and conditions were studied.
With Luciferin-H as the model substrate of CYP2C9, the CYP-IMERs showed higher activity and stability at room temperature than at +37 °C. The peak activity could be increased via optimization of the immobilization protocol, though long-term storage diminished the peak activity. The activity of the IMERs typically attenuated within 1-2 hours with little or no improvement achieved via optimization of the immobilization or operation conditions. Only upon addition of the ROS scavengers, the peak activity and stability of the CYP-IMERs could be slightly improved. After functionalization, the IMERs maintained their activity until the time of use when stored in +4 °C for up to 2 weeks, but re-use of IMERs was not possible.
Sytokromi P450 -entsyymit ovat tärkeitä katalysoijia lääkeainemetabolian ensimmäisessä vaiheessa. Noin kaksi kolmesta lääkeaineesta hapettuu CYP-entsyymien reaktioiden kautta, jotka mahdollistavat lääkeaineiden jatkofunktionalisoinnin ja niiden erittymisen elimistöstä. Tässä työssä sytokromi-P450 entsyymiä immobilisointiin tioleenista valmistettuihin mikropilarisiruihin ja arvioitiin entsyymien stabiiliutta käyttäen CYP2C9 -isoentsyymille spesifistä substraattia, Luciferin H:ta. Työn tarkoituksena oli kehittää immobilisoitujen entsyymien mikroreaktoreita (engl., immobilized enzyme reactor, IMER) entsyymikinetiikan ja lääke-lääke -interaktioiden tutkimiseen. Tätä tarkoitusta varten käisteltiin aiemmin kehitettyjen CYP-IMER:ien stabiiliuskysymyksiä.
CYP-entsyymien immobilisointiprotokolla perustui aiempien tutkimusten yhteydessä kehitettyyn käytäntöön, jossa hyödynnettiin humaanimaksamikrosomien (engl. Human liver microsomes, HLM) biotinylointiin fuusiogeenisten liposomien avulla. Nämä kiinnitettiin streptavidiinilla funktionalisoituun tioleenipintaan. CYP-aktiivisuus määriteltin NADPH:n läsnäollessa mikrofluidistiikkaa hyödyntäen jatkuvan virtauksen olosuhteissa (tyypillisesti 5 µL/min). CYP2C9 -entsyymin tuottamaa luminesoivaa metaboliittia kvantitoitiin kaupallisella luminometrillä mikroreaktorin ulostuloaukosta kerätyistä fraktioista. Erilaisten immobilisaatio-olosuhteiden tuottaman stabiiliuden vertailua varten käytettiin CYP-entsyymien aktiivisuuden puoliintumisaikaa. CYP-IMER:en stabiiliutta verrattiin virtausnopeuden ja reaktiolämpötilan vaikutusten kautta sekä antioksidatiivisten että happiradikaalien muodostumista estävien aineiden (engl. reactive oxygen species, ROS scavengers) avulla.
Eri funktionalisointivaiheiden, säilytysajan ja -olosuhteiden vaikutusta tutkittiin. CYP2C9-mallisubstraatin, Luciferin-H:n, avulla CYP-IMER:t tuottivat korkeamman aktiivisuuden huoneenlämmössä kuin +37 °C lämpötilassa. Lähtöaktiivisuutta voitiin kasvattaa immobilisointiprotokollan optimoinnin avulla, mutta pitkäaikainen säilytys pienensi sitä. IMER:en aktiivisuus vaimeni tyypillisesti 1-2 tunnin sisällä, vaikka pientä tai olematonta parannusta saatiin immobilisoinnin ja käytön aikaisella optimoinnilla. Ainoastaan happiradikaalien muodostumista estävien aineiden lisäyksellä CYP-IMER:en lähtöaktiivisuutta ja stabiiliutta saatiin hieman parannettua. Funktionalisoinnin jälkeen IMER:t säilyttivät aktiivisuutensa käyttöön asti, mikäli niitä säilytettiin +4 °C:ssa enimmillään kaksi viikkoa, mutta IMER:en uudelleenkäyttö ei ollut mahdollista.
|
| Keyword(s): | cytochrome P450 thiol-ene enzyme immobilization microfluidics sytokromi-P450 tioleeni entsyymi-immobilisointi |
Files in this item
| Files | Size | Format | View |
|---|---|---|---|
| Pihlaja_Tea_pro gradu_2017.pdf | 2.242Mb |
This item appears in the following Collection(s)
-
Faculty of Pharmacy [577]