Follikkelia stimuloivan hormonin reseptorin (FSHR) ilmentyminen trofoblastin erilaistuessa pluripotenteista kantasoluista
| Title: | Follikkelia stimuloivan hormonin reseptorin (FSHR) ilmentyminen trofoblastin erilaistuessa pluripotenteista kantasoluista |
| Author(s): | Väyrynen, Pia |
| Contributor: | University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences, Department of Biosciences |
| Discipline: | Genetics |
| Language: | Finnish |
| Acceptance year: | 2017 |
| Abstract: |
Follicle-stimulating hormone (FSH) regulates mammalian reproduction. The hormonal function of FSH is exerted through its receptor, FSHR. Hormone binding leads to signal transduction by the synthesis of the second messenger (intracellular cAMP) and the activation of other downstream signaling pathways. FSH receptors are mainly found in ovaries and testes where FSH stimulates e.g. follicular growth and spermatogenesis, respectively. It has been previously shown that FSHR mutations are linked to infertility through abnormalities in the receptor function. For example, inactivating FSHR mutation (Ala189Val) leads to arrest of follicular development in females and reduced sperm counts in males. FSH action seems to be especially critical for folliculogenesis and essential for female fertility. The development of gonads and dysfunctions affecting reproduction are the focus of our research group.
Studies of recent years have demonstrated extragonadal FSHR expression, including endothelial cells of female reproductive tract and developing placenta. The physiological relevance and function of this extragonadal FSHR is still not well known, especially during embryogenesis. In addition, the expression or function of the mutated FSHR has not been studied in any cells endogenously expressing the receptor. As a consequence, the purpose of this thesis was to study FSHR expression and function in human pluripotent stem cells (hPSCs) as a model for early human development.
The study was conducted in a human embryonic stem cell line (hESC H9, 46, XX) and two human induced pluripotent stem cell lines (hiPSC HEL127.6 and HEL128.5; 46, XX). iPSCs were obtained from female patients carrying the A189V mutation in the FSHR gene. Cells were differentiated for 8/12 days using two in vitro cell culturing protocols for distinct differentiation attempts. The first protocol (protocol D) was designed for embryonal cell differentiation, the other (trophoblast protocol) for extraembryonal differentiation. Cells at different stages of differentiation were studied with qRT-PCR and immunocytochemistry. At d8, cells were stimulated with FSH for qPCR studies and for cAMP assay.
Control cells (H9) differentiated by protocol D endogenously expressed functional FSHR. These cells responded dose-dependently to FSH stimulation by substantially increasing cAMP production, downregulating FSHR mRNA expression and altering inhibin gene expression. Patient-derived iPSCs carrying the mutation expressed FSHR as well but the receptors were non-functional as expected. Both H9 and patient-derived cells that differentiated into trophoblast-like cells with the other protocol, also expressed FSHR at low level but did not respond to FSH stimulation.
Preliminary results with protocol D indicate that the cells resemble extraembryonic cell types. The study has revealed novel information and insight about extragonadal FSHR expression and function during differentiation. However, the exact identity and the biological role of these cells is yet to be confirmed.
Follikkeleita stimuloiva hormoni (FSH) säätelee nisäkkään lisääntymiskykyä. FSH:n toiminta perustuu sen sitoutumiseen reseptoriinsa (FSHR), mikä johtaa signaalinvälitysketjun etenemisen kautta toisiolähetin, syklisen AMP:n tuotantoon ja muiden signalointireittien aktivoitumiseen. FSH-reseptoreita esiintyy ensisijaisesti munasarjoissa ja kiveksissä, joissa FSH stimuloi mm. follikkelien kasvua ja spermatogeneesia. Tutkimuksissa on havaittu, että FSHR-mutaatiot ovat yhteydessä lisääntymiskyvyttömyyteen reseptorien toiminnallisten poikkeamien johdosta. Esimerkiksi eräs inaktivoiva FSHR-mutaatio (Ala189Val) johtaa naisilla follikkelien kehityksen pysähtymiseen ja miehillä usein siemennesteen poikkeavuuksiin. FSH:n toiminta näyttäisikin olevan erityisen kriittistä follikulogeneesille ja naisen lisääntymiskyvylle. Sukurauhasten kehitystä ja fertiliteetin häiriöitä tutkitaan tutkimusryhmässämme.
Viimevuotisten tutkimusten mukaan FSHR-geeniä ilmennetään myös muualla kuin sukurauhasissa, esimerkiksi naisen lisääntymiskanavan endoteelisoluissa ja kehittyvässä istukassa. Sukurauhasten ulkopuolella esiintyvän FSHR:n fysiologista tai toiminnallista merkitystä ei tunneta hyvin, etenkään alkionkehityksen aikana. Lisäksi mutatoituneen FSHR:n ilmentymistä saati toimintaa ei ole tutkittu reseptoreita endogeenisesti ilmentävissä soluissa. Tämän tutkielman tarkoitus onkin selvittää FSHR:n ilmentymistä ja toimintaa ihmisen pluripotenttien kantasolujen (hPSC) erilaistumisessa mallina varhaiselle yksilönkehitykselle.
Tutkimuksessa hyödynnettiin kaupallista ihmisalkion kantasolulinjaa (hESC H9, 46, XX) ja kahta ihmisen indusoitua pluripotenttia kantasolulinjaa (hiPSC HEL127.6 sekä HEL128.5; 46, XX). iPS-solut olivat peräisin kahdesta naispotilaasta, jotka kantavat FSHR-geenin A189V-mutaatiota. Soluja erilaistettiin 8/12 päivää kahdella erilaisella soluviljelyprotokollalla aikeena vertailla lopputuloksena syntyviä solutyyppejä. Ensimmäisellä protokollista (protokolla D) oli tarkoitus erilaistaa alkion soluja, toinen (trofoblastiprotokolla) puolestaan kehitettiin alkion ulkopuolisten solujen erilaistamiseen. Soluja tutkittiin eri vaiheissa erilaistumista qRT-PCR-menetelmällä ja immunosytokemiallisilla värjäyksillä. Päivänä 8 soluja stimuloitiin FSH:lla qPCR:ää ja cAMP-analyysia varten.
D-protokollalla erilaistetut kontrollisolut (H9) ilmensivät endogeenisesti toiminnallista FSHR-geeniä. Solut vastasivat FSH-stimulaatioon huomattavalla cAMP-tuotannon kasvulla, FSHR:n ilmentymisen vaimennussäätelyllä sekä inhibiinigeenien ilmentymisen muutoksilla. Mutaatiota kantavat, potilasperäiset iPS-solut ilmensivät myös FSHR-geeniä, mutta odotetusti tuotettu reseptoriproteiini ei ollut funktionaalinen. Huolimatta FSHR:n ilmentymisestä mRNA-tasolla, trofoblastiprotokollan erilaistuksissa FSH-stimulaatiot eivät tuottaneet vastetta yhdelläkään solulinjoista.
Alustavien tulosten mukaan D-protokolla johtaa alkion ulkopuolisia piirteitä ilmentävien solujen erilaistumiseen. Tutkielma on tuottanut uutta tietoa sukurauhasten ulkopuolisesta FSHR-ilmentymisestä ja toiminnallisuudesta. Erilaistuneen solutyypin tunnistus ja näiden solujen biologisen merkityksen määritys jatkuu edelleen tutkimusryhmässä.
|
Files in this item
| Files | Size | Format | View |
|---|---|---|---|
| follikke.pdf | 1.741Mb |