Characterization of novel gene targets involved in biofilm formation and antibiotic susceptibility from a Staphylococcus aureus USA300 bursa aurealis transposon library
| Title: | Characterization of novel gene targets involved in biofilm formation and antibiotic susceptibility from a Staphylococcus aureus USA300 bursa aurealis transposon library |
| Author(s): | Holappa, Katri |
| Contributor: | University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences, Faculty of Biological and Environmental Sciences |
| Discipline: | General Microbiology |
| Degree program: | none |
| Specialisation: | none |
| Language: | English |
| Acceptance year: | 2018 |
| Abstract: |
Staphylococcus aureus on kommensaali bakteeri, joka on noin 30 % ihmisistä normaalimikrobiomissaan (nenänielussa ja iholla) ilman, että se aiheuttaa mitään tautia. Se on kuitenkin opportunisti patogeeni ja voi aiheuttaa pahoja iho- ja haavainfektioita, sekä keuhkokuumetta sairaalapotilailla ja virtsatieinfektioita katetroiduilla potilailla. S. aureus on vuosien saatossa muuttunut vastustuskykyiseksi lähes kaikille käytetyillä antibiooteille niiden liikakäytön vuoksi ja on siksi miltei mahdoton hoitaa joissakin tapauksissa. Metisilliinille resistentti S. aureus (MRSA) onkin jo maailmanlaajuinen ongelma sairaaloissa ja sen aiheuttamat kuolemat ovat yleistymässä. Yksi yleisimpiä MRSA -linjoja on USA300, ympäristöbakteeri, jolla on antibioottiresistenssit lisäksi kyky tuottaa paljon biofilmiä kasvualustaansa. Biofilmin tuotto yhdistettynä antibioottiresistenssiin vaikeuttaa entisestään infektioiden hoitoa. Siksi biofilmin muodostumisen molekulaaristen mekanismien tuntemus voi auttaa tutkijoita kehittämään uusia hoitomuotoja MRSA -infektioiden hoitoon ja torjuntaan.
Tutkimukseen käytettiin bursa aurealis transposonikirjastoa. Tutkimus koostui kahdesta osasta: 1. Valittujen bakteerimutanttien fenotyyppien karakterisointi sessiileissä ja dynaamisissa viljelmissä, testata mutanttien antibioottiherkkyys eri mikrobilääkkeille ja varmistaa mutatoituneen geenin hiljentyminen reaaliaika-käänteiskopiointi PCR:llä (real-time RT-PCR). 2. Tutkia geenin toimintaa toisessa isäntäbakteerissa transduktoimalla se φ11 bakteriofaagilla USA300-UAS391 EryS ja TCH1516 EryS kantoihin. Lisäksi mutanttikannat kuvattiin epifluoresenssimikroskoopilla.
Seitsemän eri mutanttia valittiin karakterisointiin: ΔHAD (HAD-superfamily hydrolase, alaryhmä IA, variantti 1), ΔNCR (koodaamaton alue), ΔausA (ei-ribosomaalinen peptidisyntetaasi), ΔoppA (oligopeptidi ABC transportterin substraattiin kiinnittyvä proteiini), ΔalfB (clumping factor B), ΔampA (sytosolinen aminopeptidaasi) ja ΔpgsA (CDP-diasyyliglyseroli--glyseroli-3-fosfaatti 3-fosfatidyylitransferaasi).
Karakterisoinnissa ilmeni muutoksia ΔoppA-, ΔausA-, ΔHAD- ja ΔpgsA -mutanteissa. Erityisesti pgsA -mutantti oli kiinnostava, sillä havaittiin myös lisääntynyt resistenssi siprofloksasiini -antibiootille. Reaaliaika RT-PCR:ssä havaittiin muutamia muutoksia geeni-ilmentymisessä, mutta niitä ei voitu varmuudella yhdistää heikentyneeseen biofilmin muodostukseen. Mikroskooppikuvista voitiin analysoida S. aureus USA300 kannan biofilmin rakenne- ja pinnanmuodonvaihtelua, mutta mutanttikantojen väliset erot eivät olleet suuria silmällä tarkasteltuna.
Tulosten varmistamiseksi suositeltavaa olisi toistaa dynaamiset testit ja RT-PCR, jotta niiden tulosten tilastollinen merkitsevyys voitaisiin vahvistaa. Lisäksi RNA-sekvensointi ja komplementaatiokokeet voisivat antaa tarkempaa tietoa geenien osuudesta biofilmin säätelyyn.
Staphylococcus aureus is a commensal bacterium in humans and approximately 30% of healthy people carry it as part of their microbiome, in the nasal cavity and skin, without any harm. However, it is an opportunistic pathogen that causes severe infections in immunocompromised and hospitalized patients. Typical infections caused by S. aureus are wound and skin infections, pneumonia and urinary tract infections in people with a medical implanted device such as for example a catheter. S. aureus has gained resistance to virtually all antibiotics over the years of excessive antibiotic consumption, making treatment nearly impossible in some cases. MRSA, methicillin resistant S. aureus, is a worldwide problem in hospitals and the mortality rate is still rising. One of the most common MRSA lineages is USA300, a community-acquired MRSA, which is notorious not only for its antibiotic resistance but also for its ability to form prolific biofilms. Biofilm production combined with antibiotic resistance complicates treatment of S. aureus even further. A detailed understanding the molecular mechanisms of biofilm formation might bring us closer to a cure for infections caused by MRSA biofilms.
The study comprised two parts. First, characterize the phenotype of the mutants under static and dynamic conditions, test the minimal inhibitory concentrations (MIC’s) for antibiotics and verify the gene knockout by real-time RT-PCR. Second, study gene function by transduction to the parental strain USA300-UAS391 EryS and a MRSA strain TCH1516 EryS to study the gene function in a different bacterial background. The methods used were cell culturing for static and dynamic biofilm as well as growth curve, fluorescence microscopy, antibiotic susceptibility testing and real-time RT-PCR.
In total seven strains were selected for characterization. The chosen seven knockouts were ΔHAD (HAD-superfamily hydrolase, subfamily IA, variant 1), non-coding region, ΔausA (non-ribosomal peptide synthetase), ΔoppA (Oligopeptide ABC transporter substrate-binding protein), ΔclfB (clumping factor B), ΔampA (cytosol aminopeptidase), and ΔpgsA (CDP-diacylglycerol--glycerol-3-phosphate 3-phosphatidyltransferase).
General characterization showed a few changes in biofilm formation for the genes ΔoppA, ΔausA, ΔHAD and ΔpgsA. Especially ΔpgsA is interesting because of increased ciprofloxacin resistance. The real-time RT-PCR showed some altered gene expression patterns, but no connection to poor biofilm formation. With fluorescence microscopy the growth patterns of USA300 transposon mutant strain biofilms could be described.
To verify the results of the characterization, further experimentation is needed, such as RNA sequencing and complementation. Also expanding the studies to other gene hits of the screening is recommended.
|
Files in this item
| Files | Size | Format | View |
|---|---|---|---|
| progradu_katri_holappa.pdf | 4.332Mb |