Identification of novel interactors of the stomatal regulator GHR1
| Title: | Identification of novel interactors of the stomatal regulator GHR1 |
| Author(s): | Huusari, Anna |
| Contributor: | University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences, Faculty of Biological and Environmental Sciences |
| Discipline: | Genetics |
| Degree program: | none |
| Specialisation: | none |
| Language: | English |
| Acceptance year: | 2018 |
| Abstract: |
Kasvit säätelevät kaasujen vaihtoa ilmarakojen kautta. Ilmaraot ovat muodostuneet huulisoluista, ja ilmarakojen sulkeutumista säätelee monimutkainen signalointiverkosto, joka reagoi erilaisiin bioottisiin ja abioottisiin ärsykkeisiin, kuten patogeeneihin, kohonneeseen ilman hiilidioksidipitoisuuteen sekä pimeyteen. Leusiini-rikkaan toistojakson omaava receptor-like kinase (LRR-RLK) GUARD CELL HYDROGEN PEROXIDE-RESISTANT1 (GHR1) on osa tätä signalointiverkostoa. Se on inaktiivinen pseudokinaasi, joka kykenee vuorovaikuttavien proteiinien avulla aktivoimaan SLOW ANION CHANNEL-ASSOCIATED1:n (SLAC1), joka on ilmarakojen sulkeutumisessa keskeinen ionikanava. GHR1:n tarkka rooli tässä signalointiverkostossa on yhä osin tuntematon, mutta on ehdotettu, että GHR1 voisi toimia alustana, johon muut proteiinit voivat kiinnittyä, tai muiden komponenttien allosteerisena säätelijänä, jota tarvitaan ilmarakojen sulkemiseksi.
Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tunnistaa uusia GHR1:n kanssa vuorovaikuttavia proteiineja. Ensin luotiin transgeenisiä kasvilinjoja, jotka ilmentävät fuusioproteiineja GHR1-YFP, GHR1W799*-YFP sekä pelkkä YFP negatiivisena kontrollina. Näiden linjojen fuusioproteiinien ekspressiotasot sekä solunsisäiset sijainnit tutkittiin. Seuraavaksi vuorovaikuttavat proteiinit puhdistettiin co-immunopresipitaation avulla ja saadut proteiinit tunnistettiin massaspektrometrian avulla. Epätodennäköiset kandidaattiproteiinit GHR1-vuorovaikuttajiksi erotettiin pois massaspektrometriasta saadusta datasta. Vuorovaikuttavien proteiinien solunsisäistä sijaintia sekä proteiiniekspressiota tutkittiin internetin tietokantojen avulla. Tieteellisen kirjallisuuden avulla selvitettiin GHR1:n kanssa vuorovaikuttavien proteiinien mahdollisia yhteyksiä GHR1:n sekä ilmarakojen sulkeutumisen kanssa.
Tässä tutkimuksessa tunnistettiin 38 vuorovaikuttajaproteiinia GHR1:lle. Kirjallisuuskatsaus toi ilmi, että monilla tunnistetuilla vuorovaikuttajaproteiineilla tiedetään olevan rooli ilmarakojen toiminnassa. Tällaisia proteiineja ovat muun muassa PLASMA MEMBRANE INTRINSIC PROTEIN2-1 (PIP2-1) sekä BETA CARBONIC ANHYDRASE 4 (BCA4), joilla tiedetään olevan rooli ilmarakojen liikkeiden säätelyssä. Tunnistetut vuorovaikutukset tulee varmistaa tulevaisuudessa itsenäisillä metodeilla ja lisäksi niiden ilmarakoihin liittyvät molekulaariset mekanismit täytyy tutkia. Tässä ensimmäistä kertaa karakterisoitu GHR1:n interaktomi paljastaa uusia osia ilmarakojen liikkeitä säätelevään signalointiverkostoon ja näin lisää ymmärrystä molekulaarisista mekanismeista ilmarakojen toiminnan takana.
Plants control the exchange of gases through the stomatal pores. Stomata are formed by guard cells and the closure of stomata are regulated via a complex signaling network in response to various biotic and abiotic stimuli, such as pathogens, elevated levels of CO2 and darkness. The leucine-rich repeat receptor-like kinase (LRR-RLK) GUARD CELL HYDROGEN PEROXIDE-RESISTANT1 (GHR1) is part of the network regulating stomatal closure. GHR1 is an inaktive pseudokinase that can activate SLOW ANION CHANNEL-ASSOCIATED1 (SLAC1), an anion channel that is crucial for stomatal closure, via interacting proteins. The exact role of GHR1 is still partly unknown, however, it has been suggested that GHR1 could function as a scaffold or as an allosteric regulator of additional components required for stomatal closure.
The aim of this study was to identify novel interactors of GHR1. First stable plant lines expressing fusion proteins GHR1-YFP, GHR1W799*-YFP and plain YFP as a negative control were generated and from these lines fusion protein expression levels and the subcellular localization were studied. Next the plant lines were used for purifying GHR1 interacting proteins with the use of co-immunoprecipitation and identification of the proteins with mass spectrometry. The unlikely GHR1 interactor candidates were then filtered from the mass spectrometry data. The subcellular localization and the protein expression of the interacting proteins were studied with the use of internet databases. Literature of the GHR1 interacting proteins were studied in order to make possible connections with GHR1 and stomatal closure.
In this study 38 GHR1 interactors were identified. Literature search revealed that many of the identified interactors had a known role in stomatal movements. These included proteins such as PLASMA MEMBRANE INTRINSIC PROTEIN2-1 (PIP2-1) and BETA CARBONIC ANHYDRASE 4 (BCA4), that are known to have a role in stomatal closure. Future work includes confirming the interactions with independent methods and studying the molecular mechanisms related to stomatal movements. The GHR1 interactome identified here for the first time reveals novel parts of the network regulating stomatal movements and thus increases our understanding of molecular mechanisms behind stomatal functions.
|
Files in this item
| Files | Size | Format | View |
|---|---|---|---|
| Huusari_Anna_Pro_Gradu_2018.pdf | 3.000Mb |