Zebrafish as a model for endotoxin induced inflammation, gut permeability and kidney injury
Title: | Zebrafish as a model for endotoxin induced inflammation, gut permeability and kidney injury |
Author(s): | Valle, Jenni |
Contributor: | University of Helsinki, Faculty of Pharmacy, Faculty of Pharmacy |
Discipline: | Pharmacology |
Degree program: | none |
Specialisation: | none |
Language: | English |
Acceptance year: | 2018 |
Abstract: |
Suoliston tulehduksella ja läpäisevyydellä arvellaan olevan merkittävä rooli monien sairauksien patofysiologiassa. Esimerkiksi tyypin 1 diabeetikoilla on havaittu merkkejä matala-asteisesta suolistotulehduksesta ja suomalaisista tyypin 1 diabeetikoista noin kolmasosalle kehittyy munuaissairaus. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli ymmärtää suolistotulehduksen ja suolen lisääntyneen läpäisevyyden vaikutusta diabeteksen komplikaatioiden, erityisesti diabeettisen nefropatian, kehittymisessä. Tulehdusmekanismit voivat olla keskeisessä roolissa taudin kehittymisessä. Lipopolysakkaridi, LPS, on endotoksiini, jota esiintyy gram-negatiivisten bakteerien ulkokalvolla. LPS aktivoi luontaista immuunijärjestelmää ja osallistuu useisiin patofysiologisiin prosesseihin, kuten kuumeen ja endotoksisen shokin kehittymiseen. LPS:n vaikutuksesta useat tulehdussytokiinit, neutrofiilit ja makrofagit aktivoituvat.
Tutkimuksen tarkoituksena oli kehittää suoliston tulehdusmalli seeprakalalla LPS-endotoksiinia käyttäen. Hypoteesina oli, että LPS yhdessä EDTA:n kanssa käynnistää tulehduksen ja lisää läpäisevyyttä seeprakalan suolessa, mikä voi johtaa LPS:n kulkeutumiseen verenkiertoon sekä mahdollisesti munuaisvaurioon. Tätä uutta seeprakalan tulehdusmallia voidaan mahdollisesti käyttää suolistotulehduksen ja munuaisvaurion patofysiologisten mekanismien tutkimiseen sekä uusien, suolistotulehdusta vähentävien lääkeaineiden seulontaan. Lisäksi oli tarkoitus tutkia intestinaalisen alkaalisen fosfataasin (IAP) käyttöä suolen läpäisevyyden ja LPS-välitteisen munuaisvaurion vähentämisessä. IAP on ohutsuolen epiteelin entsyymi, joka voi defosforylaatiolla vähentää useiden bakteerien endotoksiinien, mm. LPS:n toksisuutta, ja siten suojata suolistotulehdukselta. Fluoresoiva LPS ja EDTA injektoitiin kuuden päivän ikäisten seeprakalan poikasten suoleen mikroinjektiolla. Kaloja kuvattiin fluoresenssimikroskoopilla ja niistä tehtiin parafiinileikkeitä. L-fenyylialaniinia käytettiin IAPentsyymin toiminnan estämiseen.
Tämän uuden menetelmän avulla seeprakalojen suoleen injektoitavien aineiden määrää ja ajoitusta voidaan hyvin säädellä. Seeprakalan suolen anatomia ja toiminta ovat hyvin samankaltaisia nisäkkäiden ohutsuolen kanssa, mikä tekee siitä hyvin soveltuvan mallieläimen suolistotulehduksen tutkimiseen. Seeprakalanpoikaset ovat läpinäkyviä, joten tulehdusprosesseja voidaan kuvata mikroskoopilla käyttäen elävää, nukutettua, kalaa. Mikroinjektion haasteina ovat kalanpoikasten pieni koko ja mahdollinen injektiossa aiheutuva kudosvaurio. Lisätutkimuksia tarvitaan, jotta mallia voidaan edelleen kehittää lääkeaineiden seulontaan. Mikroskooppikuvien perusteella ei voida vielä sanoa, lisääntyikö suolen läpäisevyys seeprakalalla LPS:n vaikutuksesta tai vaikuttiko L-fenyylialaniini IAP:n toimintaa estävästi. Aikuisia seeprakaloja käyttämällä voidaan tulevaisuudessa paremmin tutkia myös kroonisen suolistotulehduksen ja mahdollisen munuaisvaurion kehittymistä.
Gut inflammation and permeability is speculated to play a major role in the pathophysiology of several human diseases. Signs of a low-grade gut inflammation in patients with type 1 diabetes (T1D) have been found. Focus of this study was to understand the role of gut inflammation and increased gut permeability in the development of diabetic complications, especially nephropathy. Approximately, one-third of Finnish patients with T1D develop kidney disease during their lifetime. Inflammatory mechanisms may have an essential role in the pathophysiology of the disease. Lipopolysaccharide, LPS, is found in the outer membrane of gram-negative bacteria. LPS activates innate immune system and triggers the activation of inflammatory cytokines, neutrophils and macrophages as well as many pathophysiological processes in vivo, for instance fever and endotoxic shock.
Aim of this study was to establish a zebrafish gut inflammation model using fluorophore conjugated endotoxin, LPS. We hypothesized that delivery of LPS in addition to EDTA in the gut of zebrafish triggers inflammation and increased gut permeability which may lead to leakage of LPS to blood stream and potentially kidney injury. This novel zebrafish inflammation model could possibly be used for studying the pathophysiological mechanisms of gut inflammation and possible kidney injury as well as for screening new anti-inflammatory drugs. In addition, this animal model can be used for studying intestinal alkaline phosphatase (IAP) in reducing gut permeability and LPS-mediated kidney damage. IAP is an enzyme produced in small-intestinal epithelium. IAP can detoxify several bacterial endotoxins including LPS and thus protect against the induction of intestinal inflammation. LPS and EDTA were delivered in the gut of 6 days old zebrafish larvae using microgavage injection. Fluorescence microscopy imaging of live zebrafish enabled following the same individual at different timepoints after injections. Paraffin sectioning of the small larvae was promising for investigating the morphology and permeability of the gut as well as possible immunostaining for detection of IAP. L-phenylalanine was used for inhibition of IAP enzyme.
Using the novel method of microinjection to gut on zebrafish larvae the timing and amount of delivered materials to gut can be controlled well. The anatomy and function of the gut in zebrafish is very similar to small intestine of mammals and the highly developed vertebrate immune system makes zebrafish an interesting model organism for studying gut inflammation and permeability. In addition, inflammatory processes can be visualized in live, intact transparent zebrafish larvae. However, the technique has a lot of challenges including small size of the fish and possible tissue damage of the fish while performing injection. More experiments need to be carried out to establish the model for drug screening. Also, along with microscopy images, a more precise way for quantification the gut permeability is needed. Based on the images it’s not yet possible to conclude whether LPS increased gut permeability or if IAP inhibition with L-phenylalanine worked in zebrafish larvae. Using adult zebrafish in the future will give more information about the chronic gut inflammation and development of possible kidney injury.
|
Keyword(s): | zebrafish endotoxin lipopolysaccharide gut permeability intestinal alkaline phosphatase diabetic nephropathy toll-like receptor seeprakala endotoksiini lipopolysakkaridi suolen läpäisevyys intestinaalinen alkaalinen fosfataasi diabeettinen nefropatia tollin kaltainen reseptori 4 |
Files in this item
Files | Size | Format | View |
---|---|---|---|
Pro gradu_Jenni Valle.pdf | 1.619Mb |
This item appears in the following Collection(s)
-
Faculty of Pharmacy [577]