Skip to main content
Login | Suomeksi | På svenska | In English

Pienikokoisten peptidien dopingseulonta virtsanäytteestä nestekromatografia kvadrupoli lentoaikamassaspektrometrialla

Show full item record

Title: Pienikokoisten peptidien dopingseulonta virtsanäytteestä nestekromatografia kvadrupoli lentoaikamassaspektrometrialla
Author(s): Tseloev, Idris
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Pharmacy, Faculty of Pharmacy
Discipline: Pharmaceutical chemistry
Degree program: none
Specialisation: none
Language: Finnish
Acceptance year: 2018
Abstract:
Työn tavoitteena oli 25 nimetyn pienikokoisten peptidihormonien ja niiden metaboliittien löytäminen virtsanäytteistä ultrakorkean suorituskyvyn nestekromatografialla käyttämällä kiinteäfaasiuuttoa esikäsittelymenetelmänä. Tämä metodi oli ensimmäinen seulonta-askel virtsanäytteiden dopinganalyysissa. Sen tavoitteena oli nopea, vertailukelpoinen ja tutkittavien yhdisteiden luotettava tunnistaminen välttäen vääriä negatiivisia ja vähentäen vääriä positiivisia tuloksia. Yhdisteiden detektointi tapahtui kvadrupoli lentoaikamassaspektrometrialla, jonka ionilähteenä toimi säkösumutusionisaatiolähde positiivisessa moodissa. Analysoitavien yhdisteiden joukossa olivat kasvuhormonin peptidiosat, gonadotropiinia vapauttavat tekijät, antidiureettiset hormonit ja niiden metaboliitit. Kaikki edellä mainitut yhdisteluokat mainitaan Maailman antidpoingtoimiston (WADA) julkaisemassa kiellettyjen yhdisteiden listassa. Työn kokeellinen osuus suoritettiin Yhdistyneet Medix Laboratoriot Oy:ssa ja sen tavoitteena oli jo aiemmin käytössä olleen seulontamenetelmän laajentaminen lisäämällä siihen yllä mainittuja yhdisteitä. Parhaimmat kokeelliset olosuhteet selvitettiin tutkimalla erilaisia parametreja liittyen näytteen valmistukseen ja instrumenttianalytiikkaan. Näytteiden esikäsittelynä toimi kiinteäfaasiuutto ja siinä käytettiin ”mixed-mode” heikkoja kationinvaihtokolonneja. Pesuja SPE:ssa oli kaksi (Milli-Q-vesi ja metanoli) ja eluointi tapahtui 5 %:lla muurahaishapolla metanolissa. Menetelmä validoitiin saannon, spesifisyyden, havaintoalarajan, stabiiliuden ja toistettavuuden suhteen. Saanto laskettiin analyyttien konsentraatiolla 10 ng/ml ja muut validointikokeet tehtiin pitoisuudella 1 ng/ml, joka on kaksi kertaa pienempi kuin WADA:n asettama vähimmäispitoisuustaso (MRPL). Saannon vaihtelivat 2,6 – 85 %:n välillä ja havaintoalarajat olivat 0,01 – 1,76 ng/ml. Menetelmä kehitettiin analysoimalla erilaisia lisäysvirtsanäytteitä (spiikattuja), jotka sisälsivät tutkittavia yhdisteitä. Validoinnin tuloksena kaikki analyytit lukuun ottamatta LHRH 1-3-OH:ta, desmopressiini 1-7-OH:ta ja TB500 1-2-OH:ta, voitiin luotettavasti tunnistaa biologisesta näytteestä. Oletettavasti esikäsittelymenetelmä ei sopinut desmopressiini 1-7-OH:lle sekä TB-500:lle sillä emme onnistuneet näkemään signaaleja näistä yhdisteistä TIC:ssa. Lisäksi LHRH 1-3-OH:n suhteen kehittämämme menetelmä ei ollut tarpeeksi spesifinen.
An ultra-high-pressure liquid chromatography method was used for simultaneous detection of 25 small peptide hormones and their metabolites in urine after solid-phase extraction. This method is first screening step in anti-doping analysis of urine samples. It should be fast, generic and able to detect any sample that may contain a prohibited substance while avoiding false negatives and reducing false positive results. Detection was achieved using quadrupole time-of-flight mass spectrometry coupled with electrospray ionization source in positive mode. Analytes included growth hormone secretagogues, gonadotropin releasing factors, anti-diuretic hormones and their metabolites which are all covered by the list of prohibited substances of the World Anti-Doping Agency (WADA). The practical part of investigation was done in United Medix Laboratories and the aim of study was to expand current screening method by adding new compounds. Optimal experimental conditions were stablished after investigation of different parameters concerning sample preparation and instrumental analysis. The extraction procedure was done by using weak cation exchange SPE with two washing steps (Milli-Q water and methanol), and elution with 5 % formic acid in methanol. The procedure was validated in terms of recovery, specificity, limits of detection, stability and robustness. Recovery was evaluated with 10 ng/ml concentration of analytes and the rest of validation procedures were done at half of minimum required performance level set by WADA (1 ng/ml). Recoveries ranged from 2,6 to 85 % with LODs from 0,01 to 1,76 ng/ml. The suitability of the method was assessed by analyzing different spiked urine specimens containing target substances.
Keyword(s): doping control analysis peptide analysis SPE UPLC QTOF dopinganalytiikka peptidianalytiikka kiinteäfaasiuutto ultrakorkea nestekromatografia kvadrupoli lentoaikamassaspektrometria


Files in this item

Files Size Format View
Gradu_Final_Tseloev Idris.pdf 2.321Mb PDF

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record