Surface modifications and stability of light-activated ICG-liposomes
| Title: | Surface modifications and stability of light-activated ICG-liposomes |
| Author(s): | Savolainen, Roosa |
| Contributor: | University of Helsinki, Faculty of Pharmacy, Faculty of Pharmacy |
| Discipline: | Biopharmaceutics |
| Degree program: | none |
| Specialisation: | none |
| Language: | English |
| Acceptance year: | 2018 |
| Abstract: |
Liposomit ovat nanokokoisia vesikkeleitä, joiden vesifaasia ympäröi lipideistä muodostunut kaksoiskalvo. Ne soveltuvat erinomaisesti lääkekantajiksi esimerkiksi silmän takaosan sairauksien hoidossa, koska niiden avulla voidaan muun muassa lisätä lääkeaineiden biologista hyötyosuutta ja stabiilisuutta sekä alentaa toksisuutta. Liposomit ovat tutkitusti turvallisia käyttää, sillä ne hajoavat elimistössä tietyn ajan kuluessa ja ne ovat biologisesti yhteensopivia elimistön solujen ja kudosten kanssa. Rakenteensa ansiosta liposomien pintaa voidaan myös helposti muokata ja funktionalisoida. Valoaktivoituvat ICG-liposomit mahdollistavat kontrolloidun lääkeaineen vapauttamisen tiettynä ajanhetkenä halutussa vaikutuskohdassa. Niiden toiminta perustuu pieneen molekyyliin nimeltä indosyaniinivihreä (ICG), joka laservalotuksen johdosta absorboi valoenergiaa ja kohottaa siten lipidikaksoiskalvon lämpötilaa paikallisesti. Tämän seurauksena sisällä oleva lääkeaine vapautuu ympäristöön.
Tyypillisesti liposomien kiertoaikaa verenkierrossa on pidennetty päällystämällä liposomit polyetyleeniglykolilla (PEG). Vaikka PEG:ä on yleisesti pidetty turvallisena ja biologisesti yhteensopivana polymeerinä, sen on kuitenkin havaittu lisäävän toistuvassa annostelussa immunologisia reaktioita ja PEG-spesifisiä vasta-aineita. Hyaluronihappo (HA) on puolestaan endogeeninen polysakkaridi, jota esiintyy runsaasti esimerkiksi lasiaisessa. Näin ollen se voisi toimia liposomien puoliintumisaikaa elimistössä pidentävänä päällysmateriaalina.
Yksi tämän tutkielman tavoitteista oli selvittää, voisiko HA:a käyttää liposomien päällystämisessä PEG:n sijaan. Jotta HA-päällystettyjä liposomeja pystyttiin valmistamaan, yksi lipidikaksoiskalvon fosfolipideistä, DSPE, oli ensiksi konjugoitava HA:n kanssa. Konjugointia varten etsittiin kirjallisuudesta mahdollisia synteesireittejä ja lopulta päädyttiin kokeilemaan kahta eri pelkistävään aminointiin perustuvaa protokollaa. Näistä kahdesta se protokolla, jossa konjugointikohtana oli HA:n aldehydiryhmä, osoittautui toimivaksi. Tämän jälkeen konjugaatti yhdistettiin DPPC:n, DSPC:n ja 18:0 Lyso PC:n kanssa ja HA-päällysteisiä liposomeja valmistettiin ohutfilmihydraatiolla ja lääkeaineen sijasta liposomien sisään kapseloitiin kalseiinia. HA-liposomeja verrattiin päällystämättömiin sekä PEGyloituihin liposomeihin tarkastelemalla niiden faasitransitiolämpötiloja, ICG absorbanssia, kokoa, polydispersiteettiä ja sekä valo- että lämpöindusoitua lääkkeen vapautumista. Yllämainittua testipatteria käytettiin myös tutkittaessa sekä HA:n että ICG:n määrän tuplaamisen vaikutuksia sekä valmistaessa pienikokoisia HA-liposomeja. HA-liposomit osoittivat samansuuntaisia tuloksia kuin PEG-päällysteiset liposomit. Tämän lisäksi HA-liposomeista oli mahdollista ekstruudata 30 nm kalvon läpi. HA:n tuplaaminen ei merkittävästi vaikuttanut tuloksiin, mutta sen sijaan ICG:n määrän tuplaaminen sai aikaan spontaania kalseiininvapautumista jo ennen lämpö- tai valoaltistusta. Näiden havaintojen perusteella HA voisi toimia PEG:n sijaan liposomien päällysmateriaalina, joskin lisätutkimuksia vaaditaan.
Toinen tutkielman tavoitteista oli arvioida neljän eri formulaation stabiilisuutta kahdessa lääkekäytön kannalta olennaisessa olosuhteessa: varastoinnissa sekä biologisessa ympäristössä. Fosfolipidien perusteella tehty oletus oli, että AL olisi ryhmän stabiilein formulaatio, ja tämän jälkeen stabiilisuus laskisi siten, että AL18 ja AL16 olisivat seuraavaksi stabiileimpia ja lopulta AL14 olisi epästabiilein. Kuten aiemmassa tutkimuksessa, myös tässä kokeessa liposomit valmistettiin ohutfilmihydraatiolla kalseiinin ollessa kapseloituna sisään. Varastointistabiilisuuskokeessa liposomeja säilytettiin HEPES puskurissa sekä 4 ºC:ssa että huoneenlämmössä kuukauden ajan. Fysiologisia olosuhteita kuvaavassa kokeessa liposomit puolestaan lisättiin joko sian lasiaiseen tai naudan sikiön seerumiin (FBS) ja näytteitä inkuboitiin 37 ºC:ssa viiden vuorokauden ajan. Koeasetelmasta riippumatta stabiilisuuden arviointia varten mitattiin aluksi liposomien faasitransitiolämpötilat sekä valo- että lämpöindusoitua lääkkeen vapautumista. Kokeen edetessä kullakin aikapisteellä mitattiin kalseiinin vapautuminen, ICG:n absorbanssi, koko sekä polydispersiteetti. Aluksi tehdyt tutkimukset vahvistivat hypoteesin testattujen formulaatioiden stabiilisuuseroista. Varastointiolosuhteissa tehdyssä stabiilisuuskokeessa kaikki muut formulaatiot paitsi AL14 näyttivät olevan stabiileja koko tutkimuksen ajan eikä selviä eroja formulaatioiden välillä ollut havaittavissa. FBS:ssä ja lasiaisessa pidetyt liposomien stabiilisuus vaihteli ja tuloksista on pääteltävissä, että näiden formulaatioiden stabiilisuus laskee alkuperäisen oletuksen mukaisesti.
Liposomes are nano-sized vesicles in which the aqueous phase is surrounded by lipid-derived bilayer. They are excellent drug vehicles for example in ocular drug delivery because they can, among other things, increase the bioavailability and stability of the drug molecules and reduce their toxicity. Liposomes are known to be safe to use, because they degrade within a certain period of time and they are biocompatible with the cells and tissues of the body. Owing to its structure, the surface of liposomes can also be easily modified and functionalized. Light-activated ICG liposomes allow drug release in a controlled manner at a given time and specific site. Their function is based on a small molecule called indocyanine green (ICG) which, after being exposed to laser light, absorbs light energy and thereby locally elevates the temperature of the lipid bilayer. As a result, the drug inside is released into the surroundings.
The blood circulation time of liposomes has often been prolonged by coating the liposomes with polyethylene glycol (PEG). Although PEG is generally regarded as a safe and biocompatible polymer, it has been found to increase immunological reactions and PEG-specific antibodies upon repeated dosing. Conversely, hyaluronic acid (HA), is an endogenous polysaccharide, which is present in abundance for instance in vitreous. Thus, it could serve as a stealth coating material which extends the otherwise short half-life of liposomes.
One of the main objectives of this thesis was to find out whether HA could be used to coat liposomes instead of PEG. In order to prepare HA-coated liposomes, one of the lipid bilayer phospholipids, DSPE, had to be first conjugated with HA. For the conjugation, potential synthesis protocols were sought from the literature. Ultimately two different reductive amination-based protocols were tested. Consequently, the protocol in which the conjugation was achieved via the aldehyde group of HA, proved to be working. Thereafter, HA-coated liposomes were prepared by thin film hydration from the newly synthesised conjugate as well as DPPC, DSPC and 18:0 Lyso PC. Calcein was encapsulated in the liposomes. HA-covered liposomes were then compared with uncoated and PEGylated liposomes by examining their phase transition temperatures, ICG absorbances, sizes, polydispersities, and both light and heat-induced drug releases. The aforementioned tests were also conducted when the effects of the HA and ICG doubling were examined and the possibility to manufacture HA liposomes with small size was assessed. HA-liposomes showed similar results as PEG-coated liposomes. In addition, successful extrusion of HA-liposomes through a 30 nm membrane was also demonstrated in the results. Doubling of HA did not significantly affect the results. In contrast, increasing the molar amount of ICG by double caused spontaneous calcein leakage even before any heat or light exposure. Based on these findings, HA could work as a coating material instead of PEG, yet further studies are required for ensuring this conclusion.
The other key objective was to evaluate the stability of four different formulations, named as AL, AL18, AL16 and AL14, in storage and biological conditions. Based on the differences in the formulation phospholipid composition, the assumption was that AL would be the most stable of the group and that the stability would decrease so that AL18 and AL16 would be the next most stable and eventually AL14 would be the least stable formulation. As in the previous study, the liposomes were prepared by thin film hydration with calcein being encapsulated inside the liposomes. In the storage stability test, liposomes were stored in HEPES buffer at either 4 °C or at room temperature for one month. In the test conducted in physiological conditions, the liposomes were added either to porcine vitreous or fetal bovine serum (FBS) and the samples were incubated at 37 ºC for five days. Regardless of the experiment, phase transition temperatures as well as light and heat-induced drug releases were initially measured. As the test progressed, calcein release, ICG absorbance, size, and polydispersity were measured at each time point. The initial measurements confirmed the hypothesis about the stability differences of tested formulations. In the storage stability test, all formulations, except AL14, appeared to be stable throughout the study and no apparent differences between the formulations or temperatures were observed. On the other hand, the stability of liposomes stored in biological matrices varied so that the liposomes were more stable in vitreous than in FBS and the stability decreased in both media as expected.
|
| Keyword(s): | liposome indocyanine green light activation thermensitive drug release hyaluronic acid stability liposomi indosyaniinivihreä valoaktivaatio lääkeaineen vapautuminen lämpöherkkä hyaluronihappo stabiilisuus |
Files in this item
| Files | Size | Format | View |
|---|---|---|---|
| Pro Gradu_Roosa Savolainen_October 2018.pdf | 1.068Mb |
This item appears in the following Collection(s)
-
Faculty of Pharmacy [577]