Three-dimensional in vitro culture methods in the differentiation of human induced pluripotent stem cells into definitive endoderm
| Title: | Three-dimensional in vitro culture methods in the differentiation of human induced pluripotent stem cells into definitive endoderm |
| Author(s): | Karhunen, Emilia |
| Contributor: | University of Helsinki, Faculty of Pharmacy, Faculty of Pharmacy |
| Discipline: | Biopharmaceutics |
| Degree program: | none |
| Specialisation: | none |
| Language: | English |
| Acceptance year: | 2018 |
| Abstract: |
In vitro viljeltyjä ihmisen hepatosyyttejä tarvitaan biolääketieteellisissä tutkimuksissa erilaisiin käyttötarkoituksiin. Maksasairauksien hoitona on yleensä elinsiirto, mutta terveiden luovuttajien puutteen takia soluterapiaa on tutkittu parempana hoitovaihtoehtona. Lääketeollisuus tarvitsee myös uusia maksamalleja lääkeainemolekyylien metabolisen profiilin tutkimiseen. Maksasta eristettyjä primaarisoluja on tutkittu soluterapiassa ja tautimallinnuksessa, mutta niiden kanssa on esiintynyt ongelmia. In vitro viljelyssä primaarisolut eivät lisäänny tehokkaasti ja niiden elinikä on lyhyt. Hepatosyyttien kaltaisiksi soluiksi erilaistetut ihmisen pluripotentit kantasolut ovat vaihtoehto primaarisoluille. Ihmisen indusoituja pluripotentteja kantasoluja on tutkittu paljon, koska niiden saatavuus on hyvä ja niihin ei liity samoja eettisiä ongelmia, joita ihmisen alkion kantasolujen käyttö aiheuttaa. Potilaan somaattisista soluista indusoidut pluripotentit kantasolut voivat tulevaisuudessa mahdollistaa jopa yksilöidyn lääkehoidon. Kypsien ja toimintakykyisten hepatosyyttien kaltaisten solujen erilaistaminen vaatii useamman vaiheen, joista ensimmäinen on solujen erilaistuminen definitiiviseksi endodermiksi (DE), joka on yksi gastrulaation aikana syntyvistä alkiokerroksista. Erilaisia tapoja erilaistaa ihmisen pluripotentteja kantasoluja DE soluiksi on esitetty. In vitro soluviljelyn pitäisi kuvata kohdekudoksen ympäristöä mahdollisimman hyvin, koska ympäristön signaalit ohjaavat solujen erilaistumista. Kolmiulotteista (3D) solujen kasvusympäristöä on tutkittu paljon, koska se matkii solujen in vivo mikroympäristöä paremmin kuin perinteinen kaksiulotteinen (2D) soluviljely.
Työn tarkoituksena oli tutkia ihmisen indusoitujen pluripotenttien kantasolujen erilaistamista DE soluiksi 3D kasvuolosuhteissa. Ennen solujen erilaistamista ROCK-inhibiittori Y-27632 molekyylin vaikutusta erilaistamisprosessissa tutkittiin. Y-27632 lisättiin erilaistamiseen käytettyyn kasvuaineliuokseen joka päivä 6 päivää kestävän erilaistamisprosessin aikana, koska tutkimustulosten perusteella Y-27632 molekyylillä ei ollut merkittävää vaikutusta merkkigeenien ilmentymiseen, mutta solujen elinkyky ja sferoidien muodostuminen parantui Y-27632 käsittelyn ansiosta. Päätavoite työssä oli myös tutkia erilaisten 3D kasvuympäristöjen sekä kantasolu sferoidien koon vaikutusta ihmisen pluripotenttien kantasolujen erilaistumisessa DE soluiksi. Soluja erilaistettiin suspensiossa sekä kahdessa erilaisessa hydrogeelissä: nanofibrillaarisessa selluloosa (NFC) hydrogeelissä ja solujen luonnollisen tyvikalvon ainesosista muodostuneessa hydrogeelissä (BME). Sferoidien koot tutkimuksissa olivat: 200-, 500- ja 1000 solua/sferoidi.
Kantasolujen erilaistumista tutkittiin seuraamalla DE merkkigeenien (HNF3B, SOX17, CXCR4, CER1), kantasolu merkkigeeni OCT4n, mesendodermi merkkigeeni Brachyuryn ja hepatoblasti merkkigeeni HNF4An proteiinien ja mRNAn ilmentymistä soluissa. Suspensio ja NFC kasvuolosuhteissa erilaistetut sferoidit analysoitiin käyttäen CXCR4 ja 7-AAD kaksoisvärjäystä ja virtaussytometriaa, jotta elävien DE positiivisten ja kuolleiden solujen osuus saatiin selville. Tärkeimpien merkkigeenien ilmentymistä tutkittiin myös immunofluoresenssivärjäyksen ja konfokaalimikroskopian keinoin. BME hydrogeelissä erilaistettujen solujen elinkykyisyys selvitettiin myös konfokaalimikroskopian avulla. Solujen immunofluoresenssivärjäys- ja elinkykyisyystutkimusten tulosten sekä solujen morfologian perusteella BME hydrogeeli jätettiin pois myöhemmistä tutkimuksista. Tutkimustulosten mukaan, suspensioviljelmässä olevat sferoidit aloittivat erilaistumisen DE soluiksi nopeammin kuin sferoidit NFC hydrogeelissä. Solujen erilaistaminen 3D suspensioviljelmässä ja NFC hydrogeelissä tuotti suuren määrän eläviä CXCR4 positiivisia soluja virtaussytometria analyysin mukaan. Myös konfokaalimikroskopia osoitti muiden DE merkkigeenien proteiinien ilmentymisen erilaistuneissa soluissa. Työn tulosten perusteella NFC hydrogeeli tukee ihmisen pluripotenttien kantasolujen erilaistumista, mikä osoittaa sen olevan lupaava 3D kasvualusta soluille. Tutkimuksista saatujen tulosten perusteella neljä päivää kestävä pluripotenttien kantasolujen erilaistaminen DE soluiksi suspensio- sekä NFC viljelmissä olisi tehokkain tapa tuottaa riittävästi DE positiivisia soluja. Pienemmissä sferoideissa huomattiin suurempi osuus DE positiivisia soluja kuin suuremmissa sferoideissa erilaistamisprosessin ensimmäisinä päivinä. Vastakkainen tulos saatiin, kun DE merkkigeenien mRNAn ilmentymistä tutkittiin erilaistamisprosessin loppuvaiheessa. Työstä saadut tulokset viittaavat siihen, että pienemmät sferoidit erilaistuisivat tehokkaammin erilaistamisprosessin alkuvaiheessa. Lisää tutkimuksia tarvitaan, jotta voidaan vahvistaa työstä saadut tulokset sekä tehdä johtopäätöksiä eri 3D kasvualustojen mahdollisista eroavaisuuksista että saada selville parhain sferoidin koko seuraavaan erilaistamisvaiheeseen kohti toimintakykyisiä in vitro erilaistettuja hepatosyyttien kaltaisia soluja. Työstä saadut tulokset ovat kuitenkin hyödyllisiä, kun jatkotutkimuksia suunnitellaan.
Functional in vitro cultured human hepatocytes are needed in different applications in biomedical research. Treatment for liver diseases is usually liver transplantation, but due to the lack of healthy donors, cell therapy using hepatocytes is considered as a better option. Drug industry will also need representative liver models to test metabolic profiles of drug molecules. Primary human hepatocytes are studied in cell therapy and disease modelling, but they have also drawbacks. In vitro they do not proliferate efficiently, and they are short-lived. In vitro differentiated human pluripotent stem cells (hPSCs) to hepatic fate are an alternative for the primary human hepatocytes. Especially human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are widely studied because they are easily available, and they even make personalized therapy possible without problems with ethical issues related to the human embryonic stem cells (hESCs). Differentiation to hepatic fate includes several steps before mature functional hepatocyte-like cells are formed. Hepatocytes are derived from the definitive endoderm (DE) which is one of the germ layers formed in the gastrulation process. Efficient induction of hPSCs into DE lineage would be a good starting point for generating mature hepatocyte-like cells in further hepatic differentiation. Different protocols to differentiate hPSCs in vitro into DE have been published. In vitro cell culture systems should well represent the environment of the target tissue because signals from the environment guide the differentiation. Three-dimensional (3D) cell culture systems are widely studied, because they better mimic the in vivo microenvironment of cells than two-dimensional (2D) cell culture.
The aim of the thesis was to study the efficacy of the 3D differentiation of hiPSCs into DE. Before starting the 3D differentiation, differentiation protocol was optimized and the effect of ROCK inhibitor Y-27632 was investigated. Differentiation medium was supplemented with Y-27632 during the whole 6 days differentiation, because survival of the cells and formation of the spheroids were improved, and gene expression studies of pluripotency markers and several DE markers did not show evident effect of Y-27632 on the gene expression of hiPSCs. The main objective in the studies was also to investigate possible differences between different 3D culture conditions on hiPSCs differentiation into DE. Also, the effect of the spheroid size on differentiation was examined. Two different hydrogels were used as a matrix material in the experiments: basement membrane extract (BME) and nanofibrillar cellulose (NFC) hydrogels. Suspension culture was used as a biomaterial-free 3D culture system. Experiments were performed with three spheroid sizes: 200 cells/spheroid, 500 cells/spheroid and 1000 cells/spheroid.
Efficacy of differentiation to DE lineage was estimated by studying protein and mRNA expression of some of the DE markers (HNF3B, SOX17, CXCR4, CER1), pluripotency marker OCT4, mesendoderm marker Brachyury and hepatoblast marker HNF4A in the cells. Spheroids differentiated in suspension and NFC were analysed by flow cytometry to get the number of DE positive live cells and dead cells using CXCR4 and 7-AAD double staining. Besides flow cytometry, protein expression of some of the key markers were studied by immunofluorescent staining and further confocal imaging. Viability of the spheroids in BME hydrogel culture were investigated using live/dead staining followed by confocal imaging. BME hydrogel culture was left out from the further experiments due to the morphology of the spheroids and results from viability and protein expression studies. Spheroids in suspension started DE differentiation faster compared to NFC culture. Suspension and NFC cultures yielded high number of double positive cells in flow cytometry and bright fluorescence of other DE markers was seen in the confocal images. NFC hydrogel proved to be a promising 3D culture system by supporting the differentiation of hiPSCs. Flow cytometry results and gene expression studies propose that four days long 3D differentiation would be efficient to produce sufficient number of DE cells. Smaller spheroids showed higher number of DE positive cells than bigger spheroids on day 2 but gene expression studies showed difference in DE marker expression between size conditions rather in later days in differentiation and it was the opposite. Experiments showed signs of more efficient differentiation of the smaller sized spheroids in the beginning of differentiation. But further studies are needed to verify the obtained results and both draw conclusions about the possible differences between different 3D culture systems and explore the best size of the spheroid for hepatic differentiation. However, results obtained from the studies are useful for designing further experiments.
|
| Keyword(s): | human induced pluripotent stem cell definitive endoderm three-dimensional culture differentiation NFC hydrogel suspension ihmisen indusoitu pluripotentti kantasolu definitiivinen endodermi kolmiulotteinen viljely erilaistaminen NFC hydrogeeli suspensio |
Files in this item
| Files | Size | Format | View |
|---|---|---|---|
| Master's_thesis_ Emilia_Karhunen.pdf | 2.069Mb |
This item appears in the following Collection(s)
-
Faculty of Pharmacy [577]