Assay Setup for High Throughput Screening to Identify Novel Efflux Pump Inhibitors against Escherichia coli

Tausta: Maailman terveysjärjestö WHO linjasi vuonna 2014 julkaisemassaan raportissa, että antibioottiresistenssi on todellinen maailmanlaajuinen terveysuhka, jonka vastaiset toimet on käynnistettävä. Uusien antibioottien löytäminen ja kehittäminen Gram-negatiivisten bakteerien aiheuttamiin tulehduksiin on haastavaa, sillä Gram-negatiivisilla bakteereilla on luontainen puolustusmekanismi tappavia vierasaineita vastaan. Gram-negatiivisilla bakteereilla on soluseinärakenteessaan ylimääräinen kalvorakenne (ulkokalvo), joka vaikeuttaa lääkeaineiden kulkeutumista soluseinän läpi. Lisäksi Gram-negatiivisille bakteereille, kuten E. colille, on ominaista efluksipumput, joiden yli-ilmentäminen soluseinärakenteessa on seuraus efluksipumppujen pumppauskapasiteetin ylittymisestä esimerkiksi bakteereiden altistuessa pitkäjatkoisesti matalille, bakteerikasvua estämättömille antibioottipitoisuuksille. Tutkituin ja runsaimmin E. colissa esiintyvä monilääkeresistentti efluksipumppu on kolmiosainen AcrAB-TolC-proteiinikompleksi, joka ulottuu koko soluseinärakenteen läpi, pumpaten solun sisältä solunulkoiseen tilaan laajan kirjon rakenteellisesti toisistaan poikkeavia yhdisteitä, aiheuttaen lopulta ristilääkeaineresistenssiä useammalle eri antibioottiryhmälle. Onkin ehdotettu, että nykyisten antibioottien teho voitaisiin palauttaa yhdistämällä lääkehoitoon efluksipumppuinhibiittori (EPI), jolloin terapeuttinen antibioottipitoisuus voitaisiin solunsisäisesti saavuttaa uudelleen. Tavoitteet: Tehoseulontamenetelmän koeolosuhteiden ja positiivisen kontrollin määrittäminen uusien EPIen löytämiseksi. Menetelmä koostuu korkean efluksiaktiivisuuden omaavasta E. coli -kannasta sekä yhdestä EPIstä ja yhdestä antibiootista, molemmat yksittäisellä pitoisuudella testattuna. Tutkimuksessamme valikoitunut EPI toimii tehoseulontamenetelmän positiivisena kontrollina. Menetelmät: Seitsemän E. coli -kannan efluksiaktiivisuus määritettiin Hoechst 33342 (H33342) -kumuloitumiskokeella, sekä ilman että yhdessä viiden EPIn kanssa. Samaa menetelmää hyödynnettiin annos-vastekokeissa, joissa EPIen optimaalinen annos selvitettiin. Matalin bakteerikasvua estävä lääkeainepitoisuus (MIC-arvo) määritettiin mikrolaimennosmenetelmällä CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) -ohjeiston mukaisesti. Antibiootin ja EPIn keskinäistä synergismiä ja EPIn kykyä laskea antibiootin MIC-arvoa tutkittiin 96-kuoppalevyllä Biomek i7 -robotiikkaa hyödyntäen. Datan analysoimiseen käytettiin Microsoft Exceliä sekä IBM SPSS Statistics -tilasto-ohjelmaa (versio 25). Tulokset ja pohdinta: E. coli ATCC 25922 -kannalla oli korkein efluksiaktiivisuus kaikista villityypin patogeenisistä ja ei-patogeenisistä E. coli -kannoista. H33342-kumuloitumiskoe yhdessä viiden EPIn kanssa kuitenkin osoitti, että uropatogeeninen E. coli BAA1161 nosti solunsisäistä H33342:n vakaan tilan pitoisuutta voimakkaimmin. Meflokiini osoittautui potenteimmaksi EPIksi H33342-kumuloitumiskokeeseen valikoituneilla pitoisuuksilla testattuna. Odotusten vastaisesti meflokiini nosti H33342:n vakaan tilan pitoisuutta myös E. coli JW5503 -kannassa (ΔtolC). Siten tulos saattaisi viitata siihen, että meflokiini vaikuttaa epäselektiivisesti muillakin tavoin tai vaihtoehtoisesti toimii inhibiittorina useammalle eri efluksipumppualatyypille. Annos-vastekokeet E. coli JW5503 -kannalla ehdottivat CCCP:n ja meflokiinin optimaalisiksi annoksiksi 1.25 g/ml ja 0.5 g/ml. Meflokiinin annos osoittautui kuitenkin liian matalaksi kuudella muulla E. coli -kannalla testattuna ja siten synergiatestiin valikoitiin korkeammat pitoisuudet meflokiinia siten, että kokeessa testattu maksimipitoisuus meflokiiniä oli puolet sen MIC-arvosta. Antibakteerisessa herkkyysmäärityksessä E. coli BAA1161 osoittautui ainoaksi resistentiksi kannaksi, ja MIC-suhdeluvut (villityypin MIC/mutantin MIC) tetrasykliinille ja piperasilliinille olivat 512 ja 2048. Piperasilliini ja ofloksasiini, joiden MIC-suhdeluku oli vähintään 4 ainakin kahdella eri E. coli -kannalla, valikoituvat lopulta synergiatestiin. Meflokiini laski piperasilliinin MIC-arvoa 16-kertaisesti ja CCCP jopa 32-kertaisesti E. coli BAA1161 -kannalla. Johtopäätökset: E. coli BAA1161 valikoitui kannaksi uusien EPIen tehoseulontamenetelmään, koska suurin nousu H33342:n vakaan tilan pitoisuudessa havaittiin E. coli BAA1161 -kannalla. Lisäksi E. coli BAA1161 oli ainoa kanta, jolla osoitettiin olevan antibioottiresistenssiä, joka vastaavasti saatiin kumoutumaan EPIen vaikutuksesta. Meflokiinin (16 g/ml) kyky tehostaa piperasilliinin antibakteerista vaikutusta selittyi todennäköisesti efluksipumppuinhibitiolla, ei meflokiinin antibakteerisella teholla. Piperasilliini (256 g/ml) oli sen sijaan ainoa antibiootti, jonka antibakteerinen teho voimistui meflokiinin ja CCCP:n vaikutuksesta.