Skip to main content
Login | Suomeksi | På svenska | In English

Assay Setup for High Throughput Screening to Identify Novel Efflux Pump Inhibitors against Escherichia coli

Show simple item record

dc.date.accessioned 2019-01-21T14:07:29Z
dc.date.available 2019-01-21T14:07:29Z
dc.date.issued 2019-01-21
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/123456789/22079
dc.title Assay Setup for High Throughput Screening to Identify Novel Efflux Pump Inhibitors against Escherichia coli en
ethesis.discipline Biofarmasia fi
ethesis.discipline Biopharmaceutics en
ethesis.discipline Biofarmaci sv
ethesis.discipline.URI http://data.hulib.helsinki.fi/id/far-1
ethesis.department.URI http://data.hulib.helsinki.fi/id/9a2784ea-4d84-40d4-a651-895ae66a37ea
ethesis.department Farmasian tiedekunta fi
ethesis.department Faculty of Pharmacy en
ethesis.department Farmaceutiska fakulteten sv
ethesis.faculty Farmasian tiedekunta fi
ethesis.faculty Faculty of Pharmacy en
ethesis.faculty Farmaceutiska fakulteten sv
ethesis.faculty.URI http://data.hulib.helsinki.fi/id/9a2784ea-4d84-40d4-a651-895ae66a37ea
ethesis.university.URI http://data.hulib.helsinki.fi/id/50ae46d8-7ba9-4821-877c-c994c78b0d97
ethesis.university Helsingfors universitet sv
ethesis.university University of Helsinki en
ethesis.university Helsingin yliopisto fi
dct.creator Yrjänheikki, Ulla
dct.issued 2019
dct.language.ISO639-2 eng
dct.abstract Tausta: Maailman terveysjärjestö WHO linjasi vuonna 2014 julkaisemassaan raportissa, että antibioottiresistenssi on todellinen maailmanlaajuinen terveysuhka, jonka vastaiset toimet on käynnistettävä. Uusien antibioottien löytäminen ja kehittäminen Gram-negatiivisten bakteerien aiheuttamiin tulehduksiin on haastavaa, sillä Gram-negatiivisilla bakteereilla on luontainen puolustusmekanismi tappavia vierasaineita vastaan. Gram-negatiivisilla bakteereilla on soluseinärakenteessaan ylimääräinen kalvorakenne (ulkokalvo), joka vaikeuttaa lääkeaineiden kulkeutumista soluseinän läpi. Lisäksi Gram-negatiivisille bakteereille, kuten E. colille, on ominaista efluksipumput, joiden yli-ilmentäminen soluseinärakenteessa on seuraus efluksipumppujen pumppauskapasiteetin ylittymisestä esimerkiksi bakteereiden altistuessa pitkäjatkoisesti matalille, bakteerikasvua estämättömille antibioottipitoisuuksille. Tutkituin ja runsaimmin E. colissa esiintyvä monilääkeresistentti efluksipumppu on kolmiosainen AcrAB-TolC-proteiinikompleksi, joka ulottuu koko soluseinärakenteen läpi, pumpaten solun sisältä solunulkoiseen tilaan laajan kirjon rakenteellisesti toisistaan poikkeavia yhdisteitä, aiheuttaen lopulta ristilääkeaineresistenssiä useammalle eri antibioottiryhmälle. Onkin ehdotettu, että nykyisten antibioottien teho voitaisiin palauttaa yhdistämällä lääkehoitoon efluksipumppuinhibiittori (EPI), jolloin terapeuttinen antibioottipitoisuus voitaisiin solunsisäisesti saavuttaa uudelleen. Tavoitteet: Tehoseulontamenetelmän koeolosuhteiden ja positiivisen kontrollin määrittäminen uusien EPIen löytämiseksi. Menetelmä koostuu korkean efluksiaktiivisuuden omaavasta E. coli -kannasta sekä yhdestä EPIstä ja yhdestä antibiootista, molemmat yksittäisellä pitoisuudella testattuna. Tutkimuksessamme valikoitunut EPI toimii tehoseulontamenetelmän positiivisena kontrollina. Menetelmät: Seitsemän E. coli -kannan efluksiaktiivisuus määritettiin Hoechst 33342 (H33342) -kumuloitumiskokeella, sekä ilman että yhdessä viiden EPIn kanssa. Samaa menetelmää hyödynnettiin annos-vastekokeissa, joissa EPIen optimaalinen annos selvitettiin. Matalin bakteerikasvua estävä lääkeainepitoisuus (MIC-arvo) määritettiin mikrolaimennosmenetelmällä CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) -ohjeiston mukaisesti. Antibiootin ja EPIn keskinäistä synergismiä ja EPIn kykyä laskea antibiootin MIC-arvoa tutkittiin 96-kuoppalevyllä Biomek i7 -robotiikkaa hyödyntäen. Datan analysoimiseen käytettiin Microsoft Exceliä sekä IBM SPSS Statistics -tilasto-ohjelmaa (versio 25). Tulokset ja pohdinta: E. coli ATCC 25922 -kannalla oli korkein efluksiaktiivisuus kaikista villityypin patogeenisistä ja ei-patogeenisistä E. coli -kannoista. H33342-kumuloitumiskoe yhdessä viiden EPIn kanssa kuitenkin osoitti, että uropatogeeninen E. coli BAA1161 nosti solunsisäistä H33342:n vakaan tilan pitoisuutta voimakkaimmin. Meflokiini osoittautui potenteimmaksi EPIksi H33342-kumuloitumiskokeeseen valikoituneilla pitoisuuksilla testattuna. Odotusten vastaisesti meflokiini nosti H33342:n vakaan tilan pitoisuutta myös E. coli JW5503 -kannassa (ΔtolC). Siten tulos saattaisi viitata siihen, että meflokiini vaikuttaa epäselektiivisesti muillakin tavoin tai vaihtoehtoisesti toimii inhibiittorina useammalle eri efluksipumppualatyypille. Annos-vastekokeet E. coli JW5503 -kannalla ehdottivat CCCP:n ja meflokiinin optimaalisiksi annoksiksi 1.25 g/ml ja 0.5 g/ml. Meflokiinin annos osoittautui kuitenkin liian matalaksi kuudella muulla E. coli -kannalla testattuna ja siten synergiatestiin valikoitiin korkeammat pitoisuudet meflokiinia siten, että kokeessa testattu maksimipitoisuus meflokiiniä oli puolet sen MIC-arvosta. Antibakteerisessa herkkyysmäärityksessä E. coli BAA1161 osoittautui ainoaksi resistentiksi kannaksi, ja MIC-suhdeluvut (villityypin MIC/mutantin MIC) tetrasykliinille ja piperasilliinille olivat 512 ja 2048. Piperasilliini ja ofloksasiini, joiden MIC-suhdeluku oli vähintään 4 ainakin kahdella eri E. coli -kannalla, valikoituvat lopulta synergiatestiin. Meflokiini laski piperasilliinin MIC-arvoa 16-kertaisesti ja CCCP jopa 32-kertaisesti E. coli BAA1161 -kannalla. Johtopäätökset: E. coli BAA1161 valikoitui kannaksi uusien EPIen tehoseulontamenetelmään, koska suurin nousu H33342:n vakaan tilan pitoisuudessa havaittiin E. coli BAA1161 -kannalla. Lisäksi E. coli BAA1161 oli ainoa kanta, jolla osoitettiin olevan antibioottiresistenssiä, joka vastaavasti saatiin kumoutumaan EPIen vaikutuksesta. Meflokiinin (16 g/ml) kyky tehostaa piperasilliinin antibakteerista vaikutusta selittyi todennäköisesti efluksipumppuinhibitiolla, ei meflokiinin antibakteerisella teholla. Piperasilliini (256 g/ml) oli sen sijaan ainoa antibiootti, jonka antibakteerinen teho voimistui meflokiinin ja CCCP:n vaikutuksesta. fi
dct.abstract Background: The World Health Organization (WHO) outlined in their report published in 2014 that antimicrobial resistance (AMR) is a real public health threat worldwide and the actions against it should be taken. Otherwise, the post-antibiotic era where common community-acquired infections can lead to death, could hypothetically become true. The discovery and development of novel antibiotics (ATBs) against Gram-negative bacteria (GNB)-related infections is difficult due to a dual defence mechanism: the extra protection barrier called the outer membrane and efflux pumps which GNB utilize to protect themselves against external noxious compounds. Efflux pumps are expressed at the basal level in GNB, such as E. coli, but when exposed to sub-inhibitory concentrations of ATBs and the intrinsic extruding capacity is exceeded, GNB start overexpressing these “so-called” multi-drug resistance (MDR) efflux pumps. The most abundant and studied MDR efflux pump in E. coli is a tripartite protein complex AcrAB-TolC which traverse through the bacterial cell envelope and is capable of extruding a broad range of structurally unrelated compounds, thus leading to cross-resistance against several classes of ATBs. It has been suggested that antibacterial activity of existing ATBs could be restored again by inhibiting increased efflux activity through efflux pump inhibitors (EPIs). Objectives: Define the optimal assay conditions and a positive control (EPI) to be used in high throughput screening (HTS) of novel EPIs. The assay consists of one E. coli strain of clinical relevance with high intrinsic efflux activity, one ATB and one EPI, both of them at specific concentrations defined during this study. Methods: The intrinsic efflux activities of seven E. coli strains were studied by Hoechst 33342 (H33342) accumulation assay, both in the absence and presence of five commercially available EPIs. The same assay was used in the dose-response studies in which an optimal concentration of EPIs was identified for further to be utilized in the checkerboard assays. The minimum inhibitory concentrations (MICs) were determined by broth microdilution method according to Clinical and Laboratory Standards Institute. The synergistic effects of ATB and EPI in terms of decreasing the intrinsic MIC value of the ATB were determined in the checkerboard assays partially performed by the Biomek i7 Automated Workstation. The data was analysed by using Microsoft Excel and IBM SPSS Statistics, version 25. Results and discussion: E. coli ATCC 25922 had statistically significantly the highest efflux activity of all wild-type pathogenic and non-pathogenic E. coli strains. However, when H33342 accumulation assay was carried out in conjunction with EPIs, E. coli BAA1161 (uropathogenic strain) had the highest median increase in the intracellular level of H33342. Mefloquine showed to be the most potent of all EPIs at the tested concentrations. However, mefloquine increased the intracellular H33342 accumulation even in efflux-deficient E. coli JW5503 (ΔtolC), thus possible additional modes of action or inhibitory activity towards other efflux pumps might exist. Dose-response studies carried out in ΔtolC E. coli JW5503 suggested that CCCP at 1.25 g/ml and mefloquine at 0.5 g/ml were the optimal concentrations. However, for mefloquine, when tested at 0.5 g/ml, the intracellular level of H33342 was not increased in six remaining E. coli strains. Therefore higher concentrations up to ½ MIC were tested in the checkerboard assays. In the antibacterial susceptibility testing, E. coli BAA1161 was the only strain showing resistance to tetracycline and piperacillin, resulting in MIC ratios (MIC wild-type/MIC mutant) of 512 to 2048. Piperacillin and ofloxacin, which showed a MIC ratio of 4 in two E. coli strains, were chosen to the checkerboard assays in which mefloquine reduced the intrinsic MIC of piperacillin by 16-fold and CCCP by 32-fold in E. coli BAA1161. Conclusions: E. coli BAA1161 was chosen to be used as a model strain in HTS due to the highest median increase in intracellular H33342 accumulation and also for being the only strain with resistance towards the ATBs tested. Mefloquine (16 g/ml) was the EPI of choice for the positive control in HTS because the synergistic effects observed between piperacillin and mefloquine were most probably explained by efflux pump inhibition and not by antibacterial activity of mefloquine itself. Piperacillin (256 g/ml) was selected to be used as an ATB in HTS because it was the only ATB which was potentiated by the tested EPIs. en
dct.subject AcrAB-TolC en
dct.subject checkerboard assay en
dct.subject efflux pumps en
dct.subject efflux pump inhibitors en
dct.subject Escherichia coli en
dct.subject high throughput screening en
dct.subject Hoechst 33342 en
dct.subject minimum inhibitory concentration en
dct.subject multidrug resistance en
dct.subject synergism en
dct.subject AcrAB-TolC fi
dct.subject antibakteerinen herkkyysmääritys fi
dct.subject efluksipumput fi
dct.subject efluksipumppuinhibiittorit fi
dct.subject Escherichia coli fi
dct.subject Hoechst 33342 fi
dct.subject matalin bakteerikasvua estävä lääkeainepitoisuus (MIC) fi
dct.subject monilääkeresistenssi fi
dct.subject synergiatesti fi
dct.subject tehoseulonta fi
dct.language en
ethesis.language.URI http://data.hulib.helsinki.fi/id/languages/eng
ethesis.language englanti fi
ethesis.language English en
ethesis.language engelska sv
ethesis.supervisor Tammela, Päivi
ethesis.supervisor Kidron, Heidi
ethesis.supervisor Durante Cruz, Cristina
ethesis.thesistype pro gradu -tutkielmat fi
ethesis.thesistype master's thesis en
ethesis.thesistype pro gradu -avhandlingar sv
ethesis.thesistype.URI http://data.hulib.helsinki.fi/id/thesistypes/mastersthesis
dct.identifier.ethesis E-thesisID:6b892804-747a-4d4f-9a53-e48bfeb73878
personal.identifier lib und
personal.phone lib und
studies.candidatedegree Helsingin yliopisto und
studies.candidatedegree.maturitytestlanguage suomi und
ethesis.principalprofessor Yliperttula, Marjo
dct.identifier.urn URN:NBN:fi:hulib-201901211134
dc.type.dcmitype Text
dct.alternative Escherichia colille tehokkaiden efluksipumppuinhibiittoreiden tehoseulontamenetelmän optimointi fi
ethesis.facultystudyline none und
ethesis.mastersdegreeprogram none und

Files in this item

Files Size Format View
Assay Setup for ... mela_Heidi Kidron_2018.pdf 2.968Mb PDF

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record