Identification, cloning, production and functional analysis of novel recombinase proteins for strand invasion based amplification method (SIBA®)
| Title: | Identification, cloning, production and functional analysis of novel recombinase proteins for strand invasion based amplification method (SIBA®) |
| Author(s): | Ojalehto, Tuomas |
| Contributor: | University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences, Faculty of Biological and Environmental Sciences |
| Discipline: | General Microbiology |
| Language: | English |
| Acceptance year: | 2016 |
| Abstract: |
Rekombinaasit ovat entsyymejä, jotka välittävät soluissa homologista rekombinaatiota. Rekombinaaseja on löydetty kaikista kolmesta eliökunnasta, mikä osoittaa niiden tärkeyden eliöille. Ensimmäinen rekombinaasi RecA identifioitiin ja eristettiin Escherichia coli bakteerista. Rekombinaasit eivät itsessään kykene välittämään juosteenvaihtoa homologisessa rekombinaatiossa, vaan rekombinaasimonomeerien on polymerisoitava yksijuosteiselle DNA:lle muodostaen niin kutsutun presynaptisen nukleoproteiinifilamentin. Rekombinaasit katalysoivat juosteen vaihtoa sekä sitoutuvat yksijuosteiseen DNA:han hydrolysoimalla adenosiinitrifosfaattia ATP.
Homologinen rekombinaatio on ilmiö, jossa solun rekombinaatiokoneisto tuottaa uusia genotyyppejä populaation geenipoolista. Rekombinaatiokoneistot poikkeavat toisistaan riippuen siitä, onko kyseessä prokaryyooti, eukaryootti vai virus. Yleinen malli homologiselle rekombinaatiolle on katkenneen kaksoisjuosteen korjauksen malli, jolla voidaan yleisellä tasolla kuvata rekombinaation etenemistä. Rekombinaatiokoneistot ovat hyvin monimutkaisia kokonaisuuksia eikä monestakaan tiedetä paljoa lajikohtaisella tasolla. Eukaryooteilla homologinen rekombinaatio tapahtuu meioosin ensimmäisessä profaasissa ja prokaryooteilla taas horisontaalisen geenisiirron yhteydessä.
Rekombinaaseja voidaan käyttää vakioidun lämpötilan nukleiinihappomonistusmenetelmissä kuten RPA:ssa ja SIBA:ssa. Tämän työn tarkoitus oli etsiä bakteereista sekä viruksista homologisia rekombinaaseja, kloonata ja tuottaa ne sekä tutkia niiden sitoutumiskykyä DNA:han sekä juosteenvaihtoa in vitro. Kaksi rekombinaasia bakteriofageista T2 ja RB69 todettiin olevan toiminnallisia SIBA:ssa.
Proteins responsible for homologous recombination are collectively called recombinases. They also have an important role in maintaining genome integrity. Recombinases are found in all three kingdoms of life. The first identified and characterized recombinase was RecA from Escherichia coli. Recombinases exhibit ATP hydrolysis coupled DNA-binding activity and strand exchange activities during homologous recombination. Homologous recombination produces new genetic combinations for evolution and general way to describe the different steps of homologous recombination is a DSBR model. Homologous recombination occurs in eukaryotic and prokaryotic cells during meiosis crossover and horizontal gene transfer, respectively. The homologous recombination machineries are remarkably complex and synergistic and much is not known about detailed mechanisms for a majority of the species.
More recently, recombinases have been used in isothermal nucleic acid amplification methods, mainly in recombinase polymerase amplification RPA and strand invasion based amplification SIBA. The aim of this study was to identify, clone, produce and analyze the functionality of novel recombinases from bacteria and viruses. The acitivity for single-stranded DNA binding and strand exchange was studied. The compatibility of the produced recombinases in strand invasion based amplification SIBA method was evaluated. Two recombinases from Enterobacteria phages T2 and RB69 were found to be functional and compatible in three SIBA assays.
|
| Keyword(s): | nucleic acid recombinase homologous recombination strand exchange RecA UvsX T4 T2 RB69 SIBA |
Files in this item
| Files | Size | Format | View |
|---|---|---|---|
| progradu_tuomas_ojalehto_20160909_update.pdf | 1.436Mb |