Impact of genetic variation on OATP2B1 function in vitro
| Title: | Impact of genetic variation on OATP2B1 function in vitro |
| Author(s): | Tikkanen, Alli |
| Contributor: | University of Helsinki, Faculty of Pharmacy |
| Degree program: | Master's Programme in Pharmacy |
| Specialisation: | Biopharmaceutics |
| Language: | English |
| Acceptance year: | 2019 |
| Abstract: |
OATP2B1 on muun muassa suolistossa, maksassa, aivoissa, istukassa ja lihaksissa esiintyvä kuljetinproteiini, joka siirtää paitsi endogeenisiä yhdisteitä mutta myös useita lääkeaineita solujen ulkopuolelta solujen sisään. Geneettiset poikkeavuudet kuljetinproteiineissa voivat vaikuttaa kuljetinproteiinien toimintaan, mikä voi aiheuttaa yksilöiden välisiä eroja lääkeaineiden farmakokinetiikassa tai -dynamiikassa. Tämän pro gradu tutkielman tarkoituksena oli rakentaa ja optimoida in vitro -menetelmä OATP2B1-kuljetinproteiinin kuljetusaktiivisuuden tutkimiseksi ja selvittää sen avulla yhden aminohapon muutokseen johtavien pistemutaatioiden vaikutuksia OATP2B1:n toimintaan. Pistemutaatiot tuotettiin OATP2B1:tä koodaavaan geeniin PCR-tekniikan avulla. Bakulovirustekniikkaa hyödyntäen OATP2B1-variantit ilmennettiin HEK293-nisäkässolulinjan soluissa, joissa OATP2B1:n toimintaa tutkittiin. Estroni-3-sulfaattia ja fluoresoivaa 4’,5’-dibromofluoreseiiniä (DBF) käytettiin mallisubstraattina soluunottokokeissa, joissa OATP2B1-varianttien kuljetusaktiivisuutta verrattiin villityypin kuljetusaktiivisuuteen. Aminohappomuutokset Ser486Phe ja Cys520Ser vähensivät estroni-3-sulfaatin ja DBF:n OATP2B1-välitteisen kuljetuksen lähes olemattomaksi. Myös mutaatio Thr318Ile heikensi hieman OATP2B1:n kuljetusaktiivisuutta. Varianteilla Arg312Gln, Thr392Ile tai Ser532Arg ei ollut vaikutusta kuljetusaktiivisuuteen villityyppiin verrattuna. Tutkimuksessa optimoitua menetelmää voidaan tulevaisuudessa hyödyntää OATP2B1:n toiminnan tutkimiseen. Saatujen tulosten mukaan pistemutaatiot voivat heikentää OATP2B1:n toimintaa, mutta lisää tutkimuksia tarvitaan etenkin pistemutaatioiden vaikutuksesta OATP2B1:n ekspressiotasoon ja lokalisaatioon soluissa. Tämän tutkimuksen tuloksia voidaan hyödyntää kliinisten tutkimusten tulosten ymmärtämisessä. Etenkin harvinaisten varianttien vaikutuksia on haastava tutkia in vivo, joissa otoskoot ovat tyypillisesti pieniä, minkä vuoksi menetelmää voidaan hyödyntää tällaisten varianttien vaikutusten selvittämiseksi.
Organic Anion Transporting Polypeptide 2B1 (OATP2B1) is an influx transporter expressed widely throughout the body in tissues such as intestine, liver, brain, placenta and skeletal muscle. Since many clinically used drugs are transported by OATP2B1, changes in the function of the transporter due to genetic polymorphism could lead to altered pharmacokinetics or -dynamics of OATP2B1 substrate drugs. The aim of this Master’s thesis was to create and optimize a cellular uptake assay to study the function of OATP2B1. Furthermore, the aim was to study the effects of six naturally occurring nonsynonymous single nucleotide variants on OATP2B1 transport function in vitro. With site-directed mutagenesis, single nucleotide changes were introduced into the gene coding for OATP2B1. OATP2B1 variants were expressed in human derived HEK293 cell line using baculovirus expression system. A cellular uptake assay with estrone-3-sulfate and a fluorescent probe 4’, 5’-dibromofluorescein (DBF) as substrates was set up and optimized. With the assay, OATP2B1-mediated uptake of variants was compared to the transport activity of OATP2B1 wild type. Amino acid changes Ser486Phe and Cys520Ser impaired OATP2B1 transport function severely. In addition, variant Thr318Ile transported DBF and estrone-3-sulfate less efficiently compared to OATP2B1 wild type, but Arg312Gln, Thr392Ile and Ser532Arg transport function was not affected. A method to study OATP2B1 function was created successfully. According to the results, single amino acid changes in OATP2B1 can impair OATP2B1 function. The results and method can be utilized to understand findings from pharmacogenetic studies in vivo, and to predict consequences of especially rare variants, which can be difficult to detect in small sample populations in clinical studies. However, further studies on the expression level and cellular localization of OATP2B1 variants are needed to fully characterize the impact of the variants studied.
|
| Keyword(s): | OATP2B1 transporter genetic polymorphism single nucleotide polymorphism OATP2B1 kuljetinproteiini perinnöllisyys pistemutaatio |
Files in this item
| Files | Size | Format | View |
|---|---|---|---|
| Tikkanen_Alli_Pro_gradu_2019.pdf | 1.513Mb |
This item appears in the following Collection(s)
-
Faculty of Pharmacy [538]