Solunulkoiset vesikkelit keskushermostoon kohdennattavien biomolekyylien kuljettimina

Tausta ja tavoitteet: Solut erittävät solunulkoisia vesikkeleitä (EV) ja on havaittu, että solut kommunikoivat EV:iden välityksellä. EV:t ovat liposomien kaltaisia vesikkeleitä, joiden kalvorakenne muodostuu lipidikaksoiskerroksesta ja vesikkelin sisälle jäävästä hydrofiilisesta osasta. On havaittu, että EV:t kuljettavat mm. nukleiinihappoja, lipidejä ja proteiineja. Tutkielman tavoitteena oli selvittää, voidaanko EV:iden avulla kuljettaa ei-koodaavaa RNA:ta, kuten siRNA:ta keskushermostoon veri-aivoesteen läpi. Kirjallisuuskatsauksessa perehdyttiin menetelmiin, joilla siRNA:ta oli ladattu EV:isiin ja miten ne läpäisevät veri-aivoesteen. Kokeellisessa osassa tavoitteena oli tuottaa ja eristää EV:itä sekä ladata näihin fysikaalisilla menetelmillä, kuten sonikaatio ja elektroporaatio, FAM-leimattua DNA:ta sekä siRNA:ta. Fluoresenssia mittaamalla pyrittiin osoittamaan DNA:n latautuminen EV:isiin ja siRNA ladattujen EV:iden funktionaalisuutta tutkittiin mittaamalla gapdh-geenin ilmentymistä. Menetelmät: Solunulkoiset vesikkelit tuotettiin ARPE-19 ja PC-3 soluissa. EV:t eristettiin solujen kasvatusalustasta kaksivaiheisella differentiaalisentrifugoinnilla (DC) ja puhdistettiin edelleen gradienttisentrifugoimalla (GC) käyttäen OptiPrep™-reagenssia. OptiPrep™-reagenssi puhdistettiin käyttäen Amicon 10 kDa suodatusputkia. Eristettyjen EV:iden keskimääräinen partikkelikoko ja kokojakauma määritettiin NTA-analyysillä, proteiinipitoisuus mitattiin kolorimetrisella BCA-menetelmällä ja EV:t karakterisoitiin Western blot-menetelmällä käyttäen HSP70- ja CD9-vasta-aineita. Eristettyihin EV:isiin ladattiin sonikoimalla ja elektroporaatiolla 21 nt FAM-leimattua dsDNA:ta tai siRNA:ta. Latautumaton nukleiinihappo ja OptiPrep™-reagenssi puhdistettiin EV:istä geelisuodatuskromatografialla Sephacryl (S-300)-kolonnilla. Latautumistehokkuutta tutkittiin mittaamalla EV:istä fluoresenssia (ex 485 nm, em 520 nm) ja funktionaalisuuden osoittamiseen käytettiin qPCR-menetelmää. qPCR:ssä mitattiin gapdh-geenin ilmentymistä jakautuvissa ARPE-19 soluissa. Tulokset: DC ja GC puhdistettujen ARPE-19 ja PC-3 EV:iden keskimääräinen partikkelikoko oli n. 140 nm ja ne karakterisoitiin onnistuneesti Western blot-menetelmällä. Bioreaktorissa tuotettujen PC-3 EV:iden saanto oli riittävä latauskokeisiin, mutta ARPE-19 soluissa tuotettuja EV:itä onnistuttiin tuottamaan vain vähäisiä määriä. Geelisuodatuskromatografia soveltui hyvin EV:iden puhdistamiseen vapaasta nukleiinihaposta. Sonikaatio ei aiheuttanut EV:iden hajoamista käytetyissä olosuhteissa, mutta fluoresenssimittaustulosten perusteella FAM-leimattua DNA:ta ei onnistuttu lataamaan EV:isiin. siRNA-ladattujen EV:iden funktionaalisuutta ei onnistuttu osoittamaan ARPE-19 solukokeilla. EV:itä menetettiin elektroporaation jälkeisissä puhdistuksissa suuria määriä, joten tämä menetelmä siRNA:n lataamiseen ei osoittautunut sopivaksi. Johtopäätökset: ARPE-19 EV:t tulee tuottaa bioreaktorissa, jotta EV:itä onnistutaan tuottamaan riittäviä määriä latauskokeisiin. EV:iden puhdistusprotokollaa tulee optimoida edelleen latauskokeisiin sopivaksi, koska EV:iden saanto-% oli useiden puhdistusvaiheiden jälkeen hyvin matala. Geelisuodatuskromatografia soveltuu vapaan siRNA:n puhdistamiseen EV:istä, mutta kromatografiamenetelmää tulee edelleen optimoida ja miniatyrisoida. Ladatut EV:t tulee tuottaa aseptisesti tai vaihtoehtoisesti steriloida ennen ARPE-19 solukokeita. Fysikaalinen latausmenetelmä, kuten sonikaatio, on onnistuessaan skaalattavissa suurempaan mittakaavaan. Menetelmää tulee optimoida edelleen mm. kokeilemalla korkeampia lämpötiloja ja pidempiä sonikaatioaikoja. Anturisonikaattoria voisi testata perinteisen vesihaudesonikaattorin sijaan. Kirjallisuuden perusteella solunulkoisten vesikkelien käyttö biomolekyylien kuljettimina keskushermostoon vaikuttaa lupaavalta.