Skip to main content
Login | Suomeksi | På svenska | In English

UHPLC-PDA -menetelmän kehitys ja validointi kauran avenantramidien määritykseen

Show full item record

Title: UHPLC-PDA -menetelmän kehitys ja validointi kauran avenantramidien määritykseen
Author(s): Abderhalden, Sharon
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Agriculture and Forestry
Degree program: Master's Programme in Food Sciences
Specialisation: no specialization
Language: Finnish
Acceptance year: 2019
Abstract:
Avenantramidit ovat kaurassa (Avena sativa L., Poaceae) esiintyviä hydroksikaneliantraniilihappoja, joissa antraniilihappo tai hydroksyloitu ja/tai metoksyloitu antraniilihapon johdannainen on konjugoituneena kanelihappoon amidisidoksella. Avenantramidiyhdisteitä on tunnistettu kaurasta yli 25 erilaista muotoa, joista yleisimmät ovat kuitenkin 5-hydroksiantraniilihapon ja kahvi-, ferula- tai p-kumaarihapon esterit 2c, 2f ja 2p. Avenantramideilla on todettu olevan hapettumista ja tulehduksia estäviä ominaisuuksia. Tällä hetkellä kiinnostus kauraan ja sen sisältämiin bioaktiivisiin yhdisteisiin, kuten avenantramideihin on suurta. Avenantramidien analysoinnissa on käytetty erilaisia uuttomenetelmiä ja useimmiten kvantitointi on perustunut suuren erotuskyvyn nestekromatografiaan (HPLC). Tämän tutkimuksen tavoitteena oli kehittää erittäin suuren erotuskyvyn nestekromatografiaan (UHPLC) perustuva menetelmä yleisimpien avenantramidimuotojen 2c, 2f ja 2p tutkimiseen kaurasta ja kauratuotteista. Lisäksi tavoitteena oli tunnistaa myös muita avenantramidien muotoja, kuten 2fd ja 2pd, käyttäen nestekromatografi-massaspektrometritekniikkaa (UHPLC-QTOF-MS). Tutkimuksessa optimoitiin uuttomenetelmä ja validoitiin kvantitointiin käytetty UHPLC-PDA -menetelmä. Kehitetyllä menetelmällä tutkittiin avenantramidien pitoisuudet valikoiduista kauratuotteista. Työssä todettiin, että avenantramidien määritettyihin pitoisuuksiin ja pitoisuuksien vaihtelun suuruuteen vaikuttivat näytemäärän suuruus, näytteiden homogeenisyys ja uuttoaika. Kauraleseestä- ja jauhoista mitatut pitoisuudet olivat suurempia, kun näytemääränä oli 0,5 g eikä 0,1 g. Näytteen ja liuottimen suhde 1:10 toimi erinomaisesti ja uuttoliuottimena etanoli:vesi (80:20) osoittautui tehokkaammaksi kuin etanoli:vesi pH 2,8:ssa. Partikkelikoon pienentäminen ja yön yli uutto mahdollistivat avenantramidien paremman uuttuvuuden kuin lyhyt uutto ja suurempi partikkelikoko. UHPLC-menetelmä optimoitiin käyttäen hyväksi kromatografisia parametrejä. Avenantramidit erottuivat hyväksyttävästi toisistaan ja eluoituivat seuraavassa järjestyksessä 16 minuutin ajon aikana: 2c, 2p, 2f. Tulokset olivat toistettavia, UHPLC-laitteiston toistotarkkuus oli hyväksyttävä, ja vaste oli lineaarinen testatuilla pitoisuusalueilla kaikille kolmelle avenantramidille. Avenantramidien saannot olivat 99–117 %. UHPLC-QTOF-MS -menetelmällä kauranäytteistä tunnistettiin myös muita avenantramidimuotoja, kuten 2fd, 2pd, 5p, 5f ja 3f. Avenantramidien kokonaismäärä kauranäytteissä vaihteli välillä 3–41,3 µg/g tuorepainoa kohden. Kauraleseessä niitä oli eniten ja kaurajogurtissa vähiten. Kaurajauhoissa oli eniten muotoa 2c ja vähiten muotoa 2p. Kauraleseessä, -juomassa, -välipalassa, Nyhtökaurassa ja Murussa esiintyi 2f-muotoa enemmän kuin muita muotoja. Kehitetty UHPLC-menetelmä soveltuu jatkossa yleisimpien avenantramidimuotojen 2c, 2d, ja 2p määrittämiseen kaurasta ja kauratuotteista ja sitä voidaan hyödyntää jatkossa kauratutkimuksissa. Lisäksi menetelmällä voidaan tunnistaa ja kvantitoida laajemmin myös muita avenantramidimuotoja. Optimoitu uutto osoittautui toimivaksi ja toistettavaksi jo valmiiksi homogeenisille ja prosessoiduille näytteille, mutta epähomogeenisten näytteiden uuttoa voitaisiin jatkossa optimoida entisestään.
Avenanthramides are hydroxycinnamic acids unique to oat (Avena sativa L., Poaceae). They consist of an anthranilic acid part (anthranilic acid or hydroxylated and/or methoxylated derivative of anthranilic acid) that is conjugated to a cinnamic acid part via an amide bond. More than 25 different avenanthramides are found and identified in oat. However, the most common forms are esters of 5-hydroxyanthranilic acid with caffeic (2c), ferulic (2f) and p-coumaric (2p) acids. Avenanthramides have been shown to possess antioxidant and anti-inflammatory properties. Currently there is a great interest towards oat and bioactive compounds of oat, like avenanthramides. In the previous studies there has been a lot of diversity concerning the extraction method used for analysis of avenanthramides and usually quantitation methods were based on high-performance liquid chromatography (HPLC). The aim of this research was to develop a method based on ultra-high-performance liquid chromatography (UHPLC) for the analysis of the most common forms of avenanthramides (2c, 2f and 2p) in oat and oat products. In addition, also other forms of avenanthramides, like 2fd and 2pd, were identified and quantified using liquid chromatography-mass spectrometry (UHPLC-QTOF-MS). The extraction method of avenanthramides was optimized and the UHPLC-PDA method used for quantitation was validated. Finally, the study measured the differences in concentrations of avenanthramides in different oat products. In this study it was recognized that the concentrations and the extent of variation of the concentrations of avenanthramides were affected by the sample amount, the homogeneity of the samples and the extraction time used. Especially bigger sample amount of oat flour (0.5 g) led to larger and more reproducible results than smaller amount (0.1 g). The ratio of sample and solvent 1:10 worked excellently and as an extraction solvent ethanol:water (80:20) was more efficient than tested ethanol:water (80:20) with a phosphate buffer at pH 2.8. Smaller particle size of oat flour and extraction overnight led to better extractability of avenanthramides than a short extraction of sample with larger particle size. The UHPLC method was optimized using chromatographic parameters. The avenanthramides separated from each other acceptably and were eluted as follows during the 16-minute run: 2c, 2p, 2f. The response of the UHPLC instrument was linear in the tested concentration range for all three avenanthramides. The results were reproducible, and the accuracy of the UHPLC instrument was acceptable. The recovery % for avenanthramides were 99–117%. Also, other forms of avenanthramides, like 2fd, 2pd, 5p, 5f ja 3f, were identified in different oat samples using UHPLC-QTOF-MS technique. The total amount of avenanthramides in analyzed oat samples varied between 3–41.3 µg/g per fresh weight. Oat bran included them the most and oat snack the least. Avenanthramide 2c was dominant in oat flour which included 2p the least. In oat bran, in oat drink, in oat snack, in Nyhtökaura and in Muru the avenanthramide 2f was dominant over the two other forms. The UHPLC method developed in this study can be applied to the analysis of the most common forms of avenanthramides 2c, 2f and 2p in oat and in oat products and can be used in oat research in the future. The method can also be used to identify and quantitate more widely other forms of avenanthramides in different oat products. The optimized extraction was shown to be functional and reproducible to already homogeneous and processed samples, but the extraction of non-homogeneous samples could be optimized further in the future.
Keyword(s): kaura uutto UHPLC analyysimenetelmä Avenantramidi


Files in this item

Files Size Format View
Abderhalden_Sharon_Pro_gradu_2019.pdf 964.2Kb PDF

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record