Skip to main content
Login | Suomeksi | På svenska | In English

Setup of human naïve pluripotency reversion protocol to study the function of early embryonic genes

Show full item record

Title: Setup of human naïve pluripotency reversion protocol to study the function of early embryonic genes
Author(s): Sokka, Joonas
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences
Degree program: Master's Programme in Genetics and Molecular Biosciences
Specialisation: Cell and Developmental Biology
Language: English
Acceptance year: 2019
Abstract:
Pluripotentit kantasolut (PS-solut) voivat esiintyä sekä erilaistumiseen alustetussa (primed) sekä naiivissa olomuodossa. Perinteisesti eristetyt ihmisen PS-solut edustavat myöhempää primed-tilaa alkionkehityksessä, kun taas naiivit PS-solut muistuttavat preimplantaatio vaiheen alkiorakkulan sisäsolumassaa (ICM). In-vitro tutkimuksissa ihmisen primed-PS-solut voidaan reversoida kemiallisesti tilapäisellä histoni deasetylaasin (HDAC) inhiboinnilla takaisin kohti aiempaa naiivia tilaa. Reversoidut PS-solut voidaan karakterisoida niiden morfologian sekä valittujen naiivi markkereiden ekspression perusteella käyttämällä immunosolukemiallisia sekä RT-qPCR testejä. Leusiini 20 homeoboksi (LEUTX) on yksi ensimmäisistä ekspressoiduista geeneistä varhaisessa alkionkehityksessä, ja se kykenee aktivoimaan transkription useissa geeneissä, jotka ovat ylläpidettyjä ihmisen alkion genomin aktivaation (EGA) aikana. Näihin ylläpidettyihin geeneihin mukaan lukeutuu solujen pluripotenttisuuteen yhdistettyjä geenejä. LEUTX ekspressio voisi mahdollisesti parantaa naiivi reversion tehokkuutta tai edesauttaa naiivien PS-solujen ylläpitoa ajamalla primed-PS-solujen transkriptomia kohti alkionkehityksen aiempia soluvaiheita, mahdollisesti jopa naiivia tilaa edeltäviin soluvaiheisiin. Tämän tutkielman tavoitteena oli valmistella naiivi reversio protokolla käyttöä varten ja samalla tutkia LEUTX:n vaikutusta naiivi reversioon käyttämällä valmistettua ja testattua H9 aktivaattorisolulinjaa kohdennettuun endogeenisen LEUTX ekspression aktivoimiseen. Ensin valmistettiin ehdollisesti stabiloitu CRISPRa aktivaattorisolulinja H9 soluilla kohdennettua endogeenisen geeniekspression aktivointia varten. Tämän jälkeen aktivaattorisoluihin tuotiin LEUTX-kohdentavia sekvenssispesifisiä opas-RNA:ita (gRNA). Käyttämällä valmistettua aktivaattorisolulinjaa naiivi reversioiden aikana voidaan kohdennetusti aktivoida spesifisiä geenejä, tässä tapauksessa LEUTX, mikä mahdollistaa niiden vaikutuksien tutkimisen PS-soluissa naiivi reversion aikana. Indusoidut aktivaattorisolut, joissa LEUTX oli ekspressoituna, onnistuivat reversion aikana muodostamaan neljä kertaa enemmän naiivia tilaa muistuttavia kolonioita kontrolleihin verrattuna, mutta suurin osa näistä kolonioista ei selvinnyt kasvatusmedian vaihduttua reversio protokollan lopulla. Kun reversio saatiin valmiiksi, reversoidut PS-solut karakterisoitiin naiiveiksi PS-soluiksi niiden kupolimaisen morfologian sekä primed-PS-soluihin verrattuna korkeiden naiivimarkkereiden (NANOG, KLF17, TFCP2L1 ja DNMT3L) ekspressiotasojen perusteella. Naiivi reversion protokolla saatiin valmisteltua ja optimoitua onnistuneesti, ja sen avulla voidaan jatkossa tuottaa luotettavalla tavalla ihmisen naiiveja PS-soluja tulevia tutkimuksia ja alkionkehityksen aikaisempien vaiheiden mallinnusta varten. Lisäksi valmistettu H9 aktivaattorisolulinja toimi odotetusti, ja sitä voidaan hyödyntää jatkossa valittujen geenien ekspressioiden vaikutuksien tutkimiseen reversion aikana sekä jo reversoiduissa naiivi PS-soluissa.
Pluripotent stem cells (PSC) can exists in both primed and naïve states. The conventionally derived human PSCs represent the later primed state of pluripotency during embryo development, while the naïve state resembles the inner cell mass (ICM) of pre-implantation blastocyst. Primed human PSCs can be reverted chemically by transient histone deacetylase (HDAC) inhibition back to the naïve state in vitro. The reverted PSCs can then be characterized based on their morphology and expression of selected naïve markers using immunocytochemistry and RT-qPCR assays. Leucine twenty homeobox (LEUTX) is one of the genes expressed during the early stages of embryo development and is capable of activating the transcription of multiple genes, including pluripotency-associated genes, which are upregulated during the human embryonic genome activation (EGA). LEUTX expression could potentially improve the naïve reversion efficiency or the maintenance of naïve PSCs by driving the transcriptome of primed PSCs back towards the earlier cell stages of embryo development, potentially even to cell stages that precede the naïve state. The aim of this thesis was to setup the naïve reversion protocol and study the effects of LEUTX on the reversion by using the generated and tested H9 activator cell line for targeted activation of endogenous LEUTX expression. First, a conditionally stabilized CRISPRa activator cell line was generated for targeted activation of endogenous gene expression in H9 cells. Then sequence-specific guide RNAs (gRNA) targeting LEUTX for activation were introduced to the activator cell line. Using the generated activator cell line during the naïve reversions allows the targeted activation of specific genes, here LEUTX, and thus enables studying the effects of these genes on PSCs during the naïve reversion protocol. The induced activator cells expressing LEUTX managed to form four times as many naïve resembling colonies during the reversion compared to the controls, but most of these were lost after changing the medium conditions towards the end of the protocol. After the reversion was complete, the reverted PSCs were characterized as naïve PSCs based on their domed morphology and the high expression of naïve markers NANOG, KLF17, TFCP2L1 and DNMT3L when compared to the primed PSCs. The naïve reversion protocol was set up and optimized successfully and can now be used as a reliable way of obtaining human naïve PSCs for further experiments studying and modelling the earlier developmental stages during embryo development. Furthermore, the generated H9 activator cell line worked as intended and can be utilized for studying the effects of other targeted genes during the reversion or in the reverted naïve PSCs.
Keyword(s): Primed pluripotentit kantasolut Naiivit pluripotentit kantasolut Naiivi reversio LEUTX ES-solut iPS-solut CRISPRa CRISPR/Cas Primed pluripotent stem cells Naïve pluripotent stem cells Naïve reversion LEUTX ESCs iPSCs CRISPRa CRISPR/Cas


Files in this item

Files Size Format View
Sokka_Joonas_Maisterintutkielma_2019.pdf 1.718Mb PDF

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record