Solunulkoisten vesikkelien pinnalle muodostuvan proteiinikoronan tutkimusmenetelmien kehittäminen
| Title: | Solunulkoisten vesikkelien pinnalle muodostuvan proteiinikoronan tutkimusmenetelmien kehittäminen |
| Author(s): | Niemeläinen, Elina |
| Contributor: | University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences, Faculty of Biological and Environmental Sciences |
| Discipline: | Biochemistry |
| Language: | Finnish |
| Acceptance year: | 2020 |
| Abstract: |
Solunulkoiset vesikkelit (EV:t) ovat lipidikalvon rajaamia nanokokoisia partikkeleita, joita esiintyy luonnostaan kaikissa kehon nesteissä. EV:t ovat osa elimistön normaalia toimintaa, ja ne voivat kuljettaa sisällään muun muassa proteiineja, RNA:ta ja lipidejä solujen välillä. Tämän vuoksi EV:illä on sovellusmahdollisuuksia esimerkiksi lääkeaineiden kuljettajina.
Kun nanopartikkelit joutuvat tekemisiin veriplasman kanssa, niiden pinnalle muodostuu plasmaproteiinirakenne, jota kutsutaan proteiinikoronaksi. Proteiinikoronan muodostuminen on dynaaminen prosessi, ja proteiinit sitoutuvat proteiinikoronaan riippuen niiden affiniteettista nanopartikkeleiden pintaan. Kun nanopartikkeleita halutaan annostella elimistöön, proteiinikoronalla on suuri vaikutus niiden puoliintumisaikaan ja soluunottoon.
Tämän työn tarkoituksena oli tutkia veriplasman vaikutuksesta PC-3 -solujen erittämien EV:iden pinnalle muodostuvaa proteiinikoronaa, sekä tutkia menetelmiä proteiinikoronan eristämiseen. Aluksi tuorepakastetusta plasmasta poistettiin EV:t ja lipoproteiinipartikkelit suodattamalla. Tätä suodatettua plasmaa inkuboitiin yhdessä EV:iden kanssa, minkä jälkeen vapaiden plasmaproteiinien poistoa kokeiltiin ultrafiltraatiolla. Plasmaproteiinien poistoa kokeiltiin myös geelisuodatuksella (SEC). Syntynyttä EV-proteiinikorona -kompleksia tarkasteltiin sitten SDS-PAGE:lla. EV:t karakterisoitiin nanopartikkelien jäljitysanalyysillä ja western blot -analyysillä.
Näistä kahdesta käytetystä menetelmästä, SEC vaikutti käytännöllisemmältä ja tehokkaammalta keinolta vapaiden plasmaproteiinien erottamiseksi EV-proteiinikorona -kompleksista. Menetelmä vaatii kuitenkin vielä lisää kehittämistä ja testausta, jotta se toimisi moitteettomasti.
Extracellular vesicles (EVs) are lipid bilayer-enclosed nano-sized particles that are found in all body fluids. EVs are part of normal cell functions and they can carry for example proteins, RNA and lipids between cells. This makes them potential candidates as drug delivery vehicles.
When nanoparticles are introduced to blood plasma, a plasma protein structure is formed on their surface, called the protein corona. The formation of a protein corona is a dynamic process, and the proteins are binding to the corona depending on their affinity to the nanoparticle surface. When administrating nanoparticles to cells, protein corona has a big impact on the half-life and cellular uptake of the particles.
The aim of this work was to study the plasma protein corona of PC-3 derived EVs, and to investigate methods for protein corona isolation. First, EVs and lipoprotein particles were removed from fresh frozen plasma by membrane filtration. Using this filtrated plasma, we then tested plasma-EV incubation and removing of free plasma proteins by simple ultrafiltration. Removing of free plasma proteins was also examined by size-exclusion chromatography (SEC). The resulting EV-protein corona complex was visualized with SDS-PAGE. EVs were characterized with nanoparticle tracking analysis and western blotting.
Of these two methods used, SEC appeared to be more convenient and efficient way to remove the free plasma proteins from the EV-protein corona complex. The method still requires further development and testing in order to perform optimally.
|
| Keyword(s): | solunulkoiset vesikkelit EV proteiinikorona veriplasma ultrafiltraatio geelifiltraatio SEC |
Files in this item
| Files | Size | Format | View |
|---|---|---|---|
| Niemelainen_Elina_Pro_gradu_2020.pdf | 3.977Mb |