Skip to main content
Login | Suomeksi | På svenska | In English

OATP1B3-geneettisten varianttien toiminnan tutkiminen optimoidulla in vitro-menetelmällä

Show full item record

Title: OATP1B3-geneettisten varianttien toiminnan tutkiminen optimoidulla in vitro-menetelmällä
Author(s): Suotunen, Pauliina
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Pharmacy
Degree program: Master's Programme in Pharmacy
Specialisation: Biopharmaceutics
Language: Finnish
Acceptance year: 2020
Abstract:
OATP1B3-kuljetinproteiini kuuluu orgaanisten anionien kuljetinproteiineihin (OATP), joita koodaavat SLC-geeniperheeseen kuuluvat SLCO-geenit. Se on pääasiallisesti maksan hepatosyyttien basolateraalikalvolla ekspressoituva influksi-kuljetinproteiini, joka kuljettaa monia endogeenisiä substraatteja sekä kliinisesti tärkeitä lääkeaineita kuten kilpirauhashormoneja ja statiineja hepatosyytteihin ja osallistuu siten maksametabolian ensimmäiseen vaiheeseen. SLCO1B3-geenistä löydetyt pistemutaatiot voivat vaikuttaa sen substraattien farmakokinetiikkaan ja farmakodynamiikkaan. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli pystyttää ja optimoida in vitro-menetelmä, jonka avulla voidaan tutkia OATP1B3-kuljetinproteiinia ja sen geneettisten varianttien toimintaa ja ekspressiota. Pistemutaatiot 334T>G (Ser112Ala), 699G>A (Met233Ile) ja 767G>C (Gly256Ala) sekä lopetuskodoni TAA lisättiin SLCO1B3-geeniin kohdennettua mutageneesia hyödyntäen. Rekombinantti bakulovirus-vektoreita, jotka sisälsivät OATP1B3-kuljetinproteiinin ja sen varianttien geneettisen informaation, käytettiin ohimenevästi transfektoimaan HEK293-solut. Kun substraatin inkubaatioaika ja pitoisuus sekä virusmäärä oli optimoitu sekä fluoresoiva substraatti (8-FcA) valittu, soluunottokokeella määritet-tiin OATP1B3-varianttien kuljetusaktiivisuus HEK293-soluissa. Työssä määritettiin myös keinotekoisen WTP-variantin kuljetusaktiivisuus. Ser112Ala-, Met233Ile- ja Gly256Ala-varianttien kuljetusaktiivisuudet eivät eronneet tilastollisesti merkittävästi villityypistä, vaikka Met233Ile-variantin kuljetusaktiivisuus vaikuttaa hieman heikentyneen. WTP-variantti oli puolestaan kykenemätön kuljettamaan 8-FcA:ta. Tämän tutkimuksen perusteella OATP1B3-varianttien toimintaa voidaan tutkia käyttäen ohimenevästi rekombinantti bakuloviruksilla transfektoituja HEK293-soluja. 8-FcA:ta voidaan käyttää mallisubstraattina näissä tutkimuksissa. Tutkimuksen tulokset vahvistavat aiempaa tutkimustietoa Ser112Ala-, Met233Ile- ja Gly256Ala-varianttien toiminnasta. Lisää tutkimusta tarvitaan näiden varianttien vaikutuksista OATP1B3-lääkeainesubstraattien kuljetukseen. Myös tutkimusta WTP-variantin sijainnista solussa, solukalvo- ja kokonaisekspressiosta tarvitaan, jotta voidaan luotettavasti arvioida sen toimimattomuuden syitä.
The OATP1B3 belongs to the organic anion transporting polypeptides (OATPs) encoded by the SLCO (solute carrier organic anion) genes which belongs to the SLC (solute carriers) gene superfamily. It is an influx transporter which is primarily expressed on the basolateral membrane of the hepatocytes. It transports many endogenous substrates as well as clinically important drugs such as thyroid hormones and statins into hepatocytes and thus participates in the first step of hepatic metabolism. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) of the SLCO1B3 gene can affect the pharmacokinetics and pharmacodynamics of its substrates. The aim of this study was to set up and optimize an in vitro method to study the function and expression of the OATP1B3 transporter and its genetic variants. SNPs 334T> G (Ser112Ala), 699G> A (Met233Ile) and 767G> C (Gly256Ala) and stop codon TAA were introduced into the SLCO1B3 gene by site-directed mutagenesis. Recombinant baculovirus vectors containing the genetic information of OATP1B3 and its variants were used to transiently transfect the HEK293 cells. After optimizing the substrate incubation time and concentration, as well as the viral load and selecting the fluorescent substrate (8-FcA), the uptake assay was used to determine the transport activity of the OATP1B3 variants in HEK293 cells. The transport activity of the artificial WTP variant was also investigated in this study. The transport activities of the Ser112Ala, Met233Ile and Gly256Ala variants did not change significantly from the wild type although the transport activity of the Met233Ile variant appears to be slightly impaired. In turn the WTP variant was unable to transport 8-FcA. Based on this study the function of OATP1B3 variants can be studied using recombinant baculovirus to transiently transfect the HEK293 cells. 8-FcA can be used as a probe substrate in these studies. The results of this study confirm previous knowledge of the functioning of Ser112Ala, Met233Ile and Gly256Ala variants. More studies are needed about the effects of these variants on the transport of OATP1B3 drug substrates. Also studies about the location, cell membrane and total cell expression of the WTP variant are needed to evaluate reliably the reasons of its inactivity.


Files in this item

Files Size Format View
Suotunen_Pauliina_Pro_gradu_2020.pdf 1.404Mb PDF

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record