Characterization of activator-dependent differences in platelet-derived extracellular vesicle populations
| Title: | Characterization of activator-dependent differences in platelet-derived extracellular vesicle populations |
| Author(s): | Puutio, Johanna |
| Contributor: | University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences |
| Degree program: | Master's Programme in Genetics and Molecular Biosciences |
| Specialisation: | Molecular and analytical health biosciences study track |
| Language: | English |
| Acceptance year: | 2020 |
| Abstract: |
Solunulkoiset vesikkelit (Eng: extracellular vesicles, EV:s) ovat fosfolipimembraanin rajaamia nanopartikkeleja, joita erittävät eukaryootit ja prokaryootit. Solunulkoiset vesikkelit kantavat sisällään makromolekyylejä ja singalointimolekyylejä muihin soluihin, toimien näin tärkeinä solujen välisen kommunikaation välittäjinä sekä patologisissa että homeostaattisissa oloissa. Vesikkelit ovat lisäksi hyvin kiinnostavia niiden sovellusmahdollisuuksien vuoksi diagnostiikassa ja terapeuttisissa sovelluksissa. Solunulkoiset vesikkelit ovat pieniä ja heterogeenisiä kokonsa, sisältönsä sekä solukalvon koostumuksen puolesta. Tämän vuoksi niiden karakterisoinnissa sekä eristyksessä on yhä huomattavia haasteita, eikä selkeitä analyyttisiä ja kliinisiä ohjeistuksia ole kyetty muodostamaan. Tämän vuoksi vesikkelitutkimus kaipaa kipeästi standardoituja ja luotettavia menetelmiä niiden erotteluun ja karakterisointiin.
Tässä tutkielmassa fysikaalisia ja immunokemiallisia menetelmiä sovellettiin verihiutaleperäisten EV-populaatioiden tarkasteluun. Verihiutalevesikkelit tuotettiin aktivoimalla niitä erilaisilla biokemiallisilla aktivaatiosignaaleilla. Ihmisten verihiutaleita aktivoitiin trombiinilla ja kollageenilla, sekä kalsiumionoforilla. Uutena verihiutaleaktivaattorina tutkimukseen otettiin mukaan tulehdusreaktiota kiihdyttävä S100A8/A9 -proteiinikompleksi. Aktivaattorien vaikutusta verihiutaleisiin sekä niiden erittämiin vesikkeleihin tutkittiin nanovirtaussytometrialla. Tuottuneiden vesikkelien kokojakaumaa arvioitiin nanopartikkelien jäljitysanalyysillä (Eng: nanoparticle tracking analysis, NTA) sekä asymmetrisellä poikittaisvirtauskenttävirtausfraktioinnilla (Eng: asymmetric flow field-flow fractionation, AF4), joka on uusi menetelmä vesikkelitutkimuksessa. Viimeiseksi vesikkelien solukalvomarkkereita tarkasteltiin uudella nanopartikkelien kuvantamismenetelmällä, joka perustuu fluoresoivien leimojen lokalisaatioon vesikkelin kalvolla ja jonka hyödyllisyyttä vesikkelitutkimuksessa haluttiin arvioida.
Onnistuimme tuottamaan uusia vihjeitä tavoista, joilla verihiutaleet reagoivat solunulkoisiin tulehdus- ja kudosvauriosignaaleihin vesikkelien erityksen kautta. Kun verihiutaleiden aktivointimarkkereita tarkasteltiin virtaussytometrialla, S100A8/A9 proteiini aiheutti muutoksen kalvomarkkeriproteiinien jakautumisessa verihiutaleiden ja verihiutalevesikkelien pinnalla verrattuna trombiini- kollageeniaktivaatioon sekä aktivoimattomaan kontrolliin. Lisääntynyt TLT-1 markkerin pitoisuus yhdessä alentuneen integriini aIIbb3-ekspression kanssa viittaa ilmiöön, jossa S100A8/A9 olisi saanut verihiutaleet tuottamaan vesikkelejä eri tavoin pakatuista α-jyväsistä, sen sijaan että niitä erittyisi suoraan verihiutaleen solukalvolta. TLT-1 ekspression kasvu verrattuna P- selektiinimarkkerin laskuun verihiutalevesikkelien pinnalla saattaa johtua S100A8/A9:n aiheuttamasta muutoksesta, jossa verihiutale erikoistuu aktivoituessaan vesikkelieritykseen aggregaation sijaan.
AF4 paljasti hienovaraisia, eri aktivaattoreiden aiheuttamia eroja verihiutalevesikkelien kokojakaumissa, joita ei kyetty erottamaan yhtä tarkasti jäljitysanalyysillä tai virtaussytometrialla. AF4-menetelmä optimoitiin pienten verihiutalevesikkelien tutkimukseen. Kun verihiutalevesikkelejä tarkasteltiin MALS-detektorilla, verihiutaleaktivaatio S100A8/A9-proteiinilla tuotti suurempia vesikkelejä, kuin trombiinilla ja kollageenilla aktivoidut verihiutaleet. AF4 on hellä ja monipuolinen menetelmä, jolla voidaan erotella verihiutalevesikkelien alapopulaatioita hyvin tarkasti ja on näin ollen erittäin lupaava menetelmä vesikkelien karakterisointiin ja fraktiointiin. Tulevaisuudessa AF4-MALS –menetelmä voitaisiin yhdistää fraktionkeräimeen, jolloin erotellut vesikkelipopulaatiot voidaan kerätä jatkokäsittelyä varten. Eräs jatkokäsittelymenetelmä voi tulevaisuudessa olla hyvin optimoitu nanokuvantaminen. Nämä menetelmät yhdistämällä saadaan tarkkaa tietoa vesikkelien monimuotoisista biologisista ominaisuuksista.
Extracellular vesicles (EVs) are phospholipid bilayer-enclosed nanoparticles that are secreted by eukaryotic and prokaryotic cells. EVs carry macromolecules and signalling molecules to adjacent cells and play an important role in intercellular communication under both pathologic and homeostatic conditions. Therefore, they have become of significant interest for their therapeutic, diagnostic and prognostic potential. EVs are small and highly heterogeneous in size, shape, cargo and membrane composition, posing several challenges for establishing analytical and clinical guidelines. Therefore, EV research requires standardized and robust methods for their separation and characterization.
In this study physical and immunochemical methods were employed to characterize human platelet-derived EVs (pEVs) generated from platelets activated with different external biochemical stimuli. The platelet-activating effect of the pro-inflammatory S100A8/A9 protein complex and a combination of thrombin and collagen were studied with nano flow cytometry. The size distribution of pEVs was studied with nanoparticle tracking analysis (NTA) and asymmetrical flow field-flow fractionation (AF4), which represents a newly emerging method on the EV field. Finally, fluorescent labelling and co-localization analysis were employed to characterize membrane marker composition of pEVs and assess its usefulness as an analytic tool for EV research.
We succeeded in providing new hints towards meaningful discoveries in platelet biology by characterizing the way platelets respond to inflammatory and hemostatic signals by shedding pEVs. When platelet activation markers are characterized with flow cytometry, the S100A8/A9 protein appeared to cause a shift in membrane activation markers when compared to the thrombin- collagen mix and the baseline control. Increased TLT-1 translocation and decreased integrin αIIbβ3 expression on pEV surfaces suggests that S100A8/A9 induced pEV secretion through differently packed platelet α-granules, rather than from the plasma membrane. An increase in TLT-1 expression compared to decreased P-selectin and αIIbβ3 suggests that S100A8/A9 stimulation shifts platelet phenotype towards secretion rather than aggregation. A protocol for small pEV separation with AF4-MALS was set up. With this method, subtle differences between small pEV populations were seen that were not distinguishable with NTA or flow cytometry. When investigated with AF4-MALS, S100A8/A9 induced pEVs appeared larger than those produced with thrombin- collagen activation. The mean particle sizes of the pEV populations obtained from activated platelets were generally also larger than those produced without an activator.
We tested novel methods to detect subtle differences in small EV population sizes that are easily missed with conventional methods due to their technical limitations. A well-optimised AF4 protocol can detect different pEV subpopulations and is a promising tool for EV. In the future, when AF4 is combined with a MALS detector and a fraction collector, nanoimaging of fluorescently labelled EVs could be combined with it as a downstream application to obtain information on their versatile biological functions.
|
| Keyword(s): | solunulkoiset vesikkelit verihiutaleet verihiutalevesikkelit α-jyväset S100A8/A9 nanopartikkelien jäljitysanalyysi NTA virtaussytometria asymmetrinen poikittaisvirtauskenttävirtausfraktiointi AF4 extracellular vesicles platelets platelet-derived extracellular vesicles α-granules nanoparticle tracking analysis flow cytometry nanoimaging asymmetrical flow field-flow fractionation |
Files in this item
| Files | Size | Format | View |
|---|---|---|---|
| Puutio_Johanna_masters_thesis_2020.pdf | 3.771Mb |