Skip to main content
Login | Suomeksi | På svenska | In English

Characterization of activator-dependent differences in platelet-derived extracellular vesicle populations

Show simple item record

dc.date.accessioned 2020-08-31T10:45:25Z
dc.date.available 2020-08-31T10:45:25Z
dc.date.issued 2020-08-31
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/123456789/31176
dc.title Characterization of activator-dependent differences in platelet-derived extracellular vesicle populations en
ethesis.discipline.URI none
ethesis.faculty Bio- ja ympäristötieteellinen tiedekunta fi
ethesis.faculty Faculty of Biological and Environmental Sciences en
ethesis.faculty Bio- och miljövetenskapliga fakulteten sv
ethesis.faculty.URI http://data.hulib.helsinki.fi/id/4d959249-d6aa-44fa-93ff-807dbf9ffaae
ethesis.university.URI http://data.hulib.helsinki.fi/id/50ae46d8-7ba9-4821-877c-c994c78b0d97
ethesis.university Helsingin yliopisto fi
ethesis.university University of Helsinki en
ethesis.university Helsingfors universitet sv
dct.creator Puutio, Johanna
dct.issued 2020
dct.language.ISO639-2 eng
dct.abstract Solunulkoiset vesikkelit (Eng: extracellular vesicles, EV:s) ovat fosfolipimembraanin rajaamia nanopartikkeleja, joita erittävät eukaryootit ja prokaryootit. Solunulkoiset vesikkelit kantavat sisällään makromolekyylejä ja singalointimolekyylejä muihin soluihin, toimien näin tärkeinä solujen välisen kommunikaation välittäjinä sekä patologisissa että homeostaattisissa oloissa. Vesikkelit ovat lisäksi hyvin kiinnostavia niiden sovellusmahdollisuuksien vuoksi diagnostiikassa ja terapeuttisissa sovelluksissa. Solunulkoiset vesikkelit ovat pieniä ja heterogeenisiä kokonsa, sisältönsä sekä solukalvon koostumuksen puolesta. Tämän vuoksi niiden karakterisoinnissa sekä eristyksessä on yhä huomattavia haasteita, eikä selkeitä analyyttisiä ja kliinisiä ohjeistuksia ole kyetty muodostamaan. Tämän vuoksi vesikkelitutkimus kaipaa kipeästi standardoituja ja luotettavia menetelmiä niiden erotteluun ja karakterisointiin. Tässä tutkielmassa fysikaalisia ja immunokemiallisia menetelmiä sovellettiin verihiutaleperäisten EV-populaatioiden tarkasteluun. Verihiutalevesikkelit tuotettiin aktivoimalla niitä erilaisilla biokemiallisilla aktivaatiosignaaleilla. Ihmisten verihiutaleita aktivoitiin trombiinilla ja kollageenilla, sekä kalsiumionoforilla. Uutena verihiutaleaktivaattorina tutkimukseen otettiin mukaan tulehdusreaktiota kiihdyttävä S100A8/A9 -proteiinikompleksi. Aktivaattorien vaikutusta verihiutaleisiin sekä niiden erittämiin vesikkeleihin tutkittiin nanovirtaussytometrialla. Tuottuneiden vesikkelien kokojakaumaa arvioitiin nanopartikkelien jäljitysanalyysillä (Eng: nanoparticle tracking analysis, NTA) sekä asymmetrisellä poikittaisvirtauskenttävirtausfraktioinnilla (Eng: asymmetric flow field-flow fractionation, AF4), joka on uusi menetelmä vesikkelitutkimuksessa. Viimeiseksi vesikkelien solukalvomarkkereita tarkasteltiin uudella nanopartikkelien kuvantamismenetelmällä, joka perustuu fluoresoivien leimojen lokalisaatioon vesikkelin kalvolla ja jonka hyödyllisyyttä vesikkelitutkimuksessa haluttiin arvioida. Onnistuimme tuottamaan uusia vihjeitä tavoista, joilla verihiutaleet reagoivat solunulkoisiin tulehdus- ja kudosvauriosignaaleihin vesikkelien erityksen kautta. Kun verihiutaleiden aktivointimarkkereita tarkasteltiin virtaussytometrialla, S100A8/A9 proteiini aiheutti muutoksen kalvomarkkeriproteiinien jakautumisessa verihiutaleiden ja verihiutalevesikkelien pinnalla verrattuna trombiini- kollageeniaktivaatioon sekä aktivoimattomaan kontrolliin. Lisääntynyt TLT-1 markkerin pitoisuus yhdessä alentuneen integriini aIIbb3-ekspression kanssa viittaa ilmiöön, jossa S100A8/A9 olisi saanut verihiutaleet tuottamaan vesikkelejä eri tavoin pakatuista α-jyväsistä, sen sijaan että niitä erittyisi suoraan verihiutaleen solukalvolta. TLT-1 ekspression kasvu verrattuna P- selektiinimarkkerin laskuun verihiutalevesikkelien pinnalla saattaa johtua S100A8/A9:n aiheuttamasta muutoksesta, jossa verihiutale erikoistuu aktivoituessaan vesikkelieritykseen aggregaation sijaan. AF4 paljasti hienovaraisia, eri aktivaattoreiden aiheuttamia eroja verihiutalevesikkelien kokojakaumissa, joita ei kyetty erottamaan yhtä tarkasti jäljitysanalyysillä tai virtaussytometrialla. AF4-menetelmä optimoitiin pienten verihiutalevesikkelien tutkimukseen. Kun verihiutalevesikkelejä tarkasteltiin MALS-detektorilla, verihiutaleaktivaatio S100A8/A9-proteiinilla tuotti suurempia vesikkelejä, kuin trombiinilla ja kollageenilla aktivoidut verihiutaleet. AF4 on hellä ja monipuolinen menetelmä, jolla voidaan erotella verihiutalevesikkelien alapopulaatioita hyvin tarkasti ja on näin ollen erittäin lupaava menetelmä vesikkelien karakterisointiin ja fraktiointiin. Tulevaisuudessa AF4-MALS –menetelmä voitaisiin yhdistää fraktionkeräimeen, jolloin erotellut vesikkelipopulaatiot voidaan kerätä jatkokäsittelyä varten. Eräs jatkokäsittelymenetelmä voi tulevaisuudessa olla hyvin optimoitu nanokuvantaminen. Nämä menetelmät yhdistämällä saadaan tarkkaa tietoa vesikkelien monimuotoisista biologisista ominaisuuksista. fi
dct.abstract Extracellular vesicles (EVs) are phospholipid bilayer-enclosed nanoparticles that are secreted by eukaryotic and prokaryotic cells. EVs carry macromolecules and signalling molecules to adjacent cells and play an important role in intercellular communication under both pathologic and homeostatic conditions. Therefore, they have become of significant interest for their therapeutic, diagnostic and prognostic potential. EVs are small and highly heterogeneous in size, shape, cargo and membrane composition, posing several challenges for establishing analytical and clinical guidelines. Therefore, EV research requires standardized and robust methods for their separation and characterization. In this study physical and immunochemical methods were employed to characterize human platelet-derived EVs (pEVs) generated from platelets activated with different external biochemical stimuli. The platelet-activating effect of the pro-inflammatory S100A8/A9 protein complex and a combination of thrombin and collagen were studied with nano flow cytometry. The size distribution of pEVs was studied with nanoparticle tracking analysis (NTA) and asymmetrical flow field-flow fractionation (AF4), which represents a newly emerging method on the EV field. Finally, fluorescent labelling and co-localization analysis were employed to characterize membrane marker composition of pEVs and assess its usefulness as an analytic tool for EV research. We succeeded in providing new hints towards meaningful discoveries in platelet biology by characterizing the way platelets respond to inflammatory and hemostatic signals by shedding pEVs. When platelet activation markers are characterized with flow cytometry, the S100A8/A9 protein appeared to cause a shift in membrane activation markers when compared to the thrombin- collagen mix and the baseline control. Increased TLT-1 translocation and decreased integrin αIIbβ3 expression on pEV surfaces suggests that S100A8/A9 induced pEV secretion through differently packed platelet α-granules, rather than from the plasma membrane. An increase in TLT-1 expression compared to decreased P-selectin and αIIbβ3 suggests that S100A8/A9 stimulation shifts platelet phenotype towards secretion rather than aggregation. A protocol for small pEV separation with AF4-MALS was set up. With this method, subtle differences between small pEV populations were seen that were not distinguishable with NTA or flow cytometry. When investigated with AF4-MALS, S100A8/A9 induced pEVs appeared larger than those produced with thrombin- collagen activation. The mean particle sizes of the pEV populations obtained from activated platelets were generally also larger than those produced without an activator. We tested novel methods to detect subtle differences in small EV population sizes that are easily missed with conventional methods due to their technical limitations. A well-optimised AF4 protocol can detect different pEV subpopulations and is a promising tool for EV. In the future, when AF4 is combined with a MALS detector and a fraction collector, nanoimaging of fluorescently labelled EVs could be combined with it as a downstream application to obtain information on their versatile biological functions. en
dct.subject solunulkoiset vesikkelit fi
dct.subject verihiutaleet fi
dct.subject verihiutalevesikkelit fi
dct.subject α-jyväset fi
dct.subject S100A8/A9 fi
dct.subject nanopartikkelien jäljitysanalyysi fi
dct.subject NTA fi
dct.subject virtaussytometria fi
dct.subject asymmetrinen poikittaisvirtauskenttävirtausfraktiointi fi
dct.subject AF4 fi
dct.subject extracellular vesicles en
dct.subject platelets en
dct.subject platelet-derived extracellular vesicles en
dct.subject α-granules en
dct.subject nanoparticle tracking analysis en
dct.subject flow cytometry en
dct.subject nanoimaging en
dct.subject asymmetrical flow field-flow fractionation en
dct.language en
ethesis.language.URI http://data.hulib.helsinki.fi/id/languages/eng
ethesis.language English en
ethesis.language englanti fi
ethesis.language engelska sv
ethesis.supervisor Siljander, Pia
ethesis.supervisor Palviainen, Mari
ethesis.thesistype pro gradu -tutkielmat fi
ethesis.thesistype master's thesis en
ethesis.thesistype pro gradu-avhandlingar sv
ethesis.thesistype.URI http://data.hulib.helsinki.fi/id/thesistypes/mastersthesis
dct.identifier.ethesis E-thesisID:bfafd2bb-adc4-455a-9616-aa6f434043b4
ethesis-internal.timestamp.reviewStep 2020-06-23 15:20:51:441
ethesis.principalprofessor Siljander, Pia
dct.identifier.urn URN:NBN:fi:hulib-202008313947
dc.type.dcmitype Text
dct.alternative Verihiutaleperäisten solunulkoisten vesikkelipopulaatioiden aktivaattoririippuvaisten erojen karakterisointi fi
ethesis.facultystudyline Molekulaaristen ja analyyttisten terveyden biotieteiden opintosuunta fi
ethesis.facultystudyline Molecular and analytical health biosciences study track en
ethesis.facultystudyline Molekylära och analytiska hälsans biovetenskap studieinriktning sv
ethesis.facultystudyline.URI http://data.hulib.helsinki.fi/id/SH57_133
ethesis.mastersdegreeprogram Genetiikan ja molekulaaristen biotieteiden maisteriohjelma fi
ethesis.mastersdegreeprogram Master's Programme in Genetics and Molecular Biosciences en
ethesis.mastersdegreeprogram Magisterprogrammet i genetik och molekylära biovetenskaper sv
ethesis.mastersdegreeprogram.URI http://data.hulib.helsinki.fi/id/MH57_003

Files in this item

Files Size Format View
Puutio_Johanna_masters_thesis_2020.pdf 3.771Mb PDF

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record