Analytical characterization of therapeutic monoclonal antibodies for regulatory purposes
| Title: | Analytical characterization of therapeutic monoclonal antibodies for regulatory purposes |
| Author(s): | Takala, Hanna-Elina |
| Contributor: | University of Helsinki, Faculty of Pharmacy |
| Discipline: | Biopharmaceutics |
| Language: | English |
| Acceptance year: | 2020 |
| Abstract: |
Monoklonaalisia vasta-aineita (mabi) käytetään laajasti erilaisten sairauksien, kuten syövän ja autoimmuunisairauksien hoidossa. Johtuen niiden korkeasta hinnasta ja kasvavasta kulutuksesta, terapeuttisista mabeista on tullut potentiaalisia väärennöskohteita. Tämä lisää tarvetta nopeille ja tehokkaille analyyttisille menetelmille, joiden avulla väärennökseksi epäilty mabi voidaan tunnistaa ja tarvittaessa erottaa oikeasta. Terapeuttisten mabien rakenteen runkona toimii ihmisen tai hiiren IgG, johon ainutlaatuiset, komplementaarisuutta säätelevät alueet (CDR), liitetään erilaisten yhdistelmä-DNA-tekniikoiden avulla. Mabien rakenteellisen monimutkaisuuden vuoksi niiden identifiointiin ja karakterisointiin tarvitaan yleensä useita komplementaarisia analyyttisia menetelmiä.
Tässä työssä tutkittiin kymmentä täysikokoista terapeuttista mabia, yhtä Fab-framenttia (absiksimabi) ja yhtä CTLA4-Fc-fuusioproteiinia (belatasepti) erilaisin analyyttisin menetelmin. Tavoitteena oli selvittää, soveltuvatko menetelmät tehokkaaseen mabien karakterisointiin ja identifiointiin. Kaikki mabit analysoitiin varauksen ja molekyylipainon mukaan isoelektrisellä fokusoinnilla (IEF), ei-redusoidulla ja redusoidulla SDS-PAGE:lla ja kokoerottelukromatografialla (SEC). Lisäksi kuusi mabia, absiksimabi ja belatasepti pilkottiin trypsiinillä peptideiksi, jotka analysoitiin RPLC-MS tekniikalla. Kaikkien mabien pitoisuudet määritettiin SEC menetelmän piikkien pinta-alojen perusteella sekä Bradford proteiinimäärityksellä.
Sekä ei-redusoidulla että redusoidulla SDS-PAGE -menetelmillä analysoidut mabit eivät merkittävästi erottuneet toisistaan. Molemmat SDS-PAGE -menetelmät tuovat kuitenkin merkittävää lisäarvoa identifiointiin, koska niiden avulla havaitaan immunoglobuliinin kevyt- ja raskasketjut sekä näitä yhdistävät disulfidisillat. Toisin sanoen voidaan selvittää, onko tutkittava aine vasta-aine. IEF osoitti suurempaa potentiaalia vasta-aineiden tunnistamisessa. Osalla mabeista eri isoformit erottuivat selkeästi. Parempaan erottelukykyyn ja isoelektrisen pisteen (pI) parempaan arviointiin voidaan pyrkiä optimoimalla pH gradienttia. Mabien SEC-karakterisointi molekyylikoon perusteella todettiin hankalaksi, koska johdonmukaista suhdetta teoreettisen molekyylipainon ja piikin eluutioajan perusteella mitattujen molekyylipainojen välillä ei löytynyt. Kaikesta huolimatta SEC-menetelmällä pystytään tehokkaaseen kvantitointiin ja mahdollisten proteiiniaggregaattien ja fragmenttien havaitsemiseen. Lopulta riittävä tunnistus saavutettiin analysoimalla trypsiinillä peptideiksi hajoitetut mabit RPLC-MS-laitteistolla. Tällä menetelmällä saatiin sekvenssistä katettua mabista riippuen 87–97 %. Identifiointiprosessia voidaan tehostaa tunnistamalla ensin CDR-peptidit koko sekvenssin tutkimisen sijaan.
Mabien rakenteellisen yhteneväisyyden vuoksi ei-tunnetun vasta-ainevalmisteen identifiointi vaatii useiden menetelmien yhdistelmän. Jos tutkittavalle vasta-ainenäytteelle on saatavilla alkuperäinen referenssituote, voi vertaileva analyysi käyttämällä IEF, SDS-PAGE ja kokoerottelukromatografiaa riittää. Mikäli verrokkivalmistetta ei ole saatavilla, identifiointi vaatii peptidikartan ja CDR-alueiden tunnistamisen RPLC-MS-analyysilla, joka mahdollistaa lähes absoluuttisen tunnistuksen. Lisätutkimuksia tarvitaan kaikille mabeille sopivien identifikaatiomenetelmien yhdistelmän löytämiseksi.
Monoclonal antibodies (mAbs) are widely used in the treatment of several diseases such as cancer and autoimmune diseases. Due to their high prices and growing consumption, therapeutic mAbs have become potential targets of falsification. This generates a demand for quick and efficient analytical procedures for identifying and characterizing mAbs in a case of suspected falsification. The structure of therapeutic mAbs consists of human or murine IgG framework, where unique complementarity determining regions (CDRs) are engineered with different recombinant techniques. Given the complex nature of the mAbs, they must be identified using multiple complementary analytical methods.
Ten full-sized therapeutic mAbs, Fab-fragment abciximab and CTLA4-Fc-fusion protein belatacept were studied in order to find analytical methods for efficient characterization and identification. All studied antibodies were characterized by their charge and molecular weight by isoelectric focusing (IEF) in polyacrylamide gels, native and reduced SDS-PAGE, and size exclusion chromatography (SEC). Six mAbs, abciximab and belatacept were digested with trypsin, and the cleaved peptides were further analysed by RPLC-MS. In addition, quantification methods including SEC peak area measurements and Bradford protein assay were performed for all antibodies.
As expected, SDS-PAGE of non-reduced and reduced mAbs gave little distinction between the mAbs. Both methods were however shown to be useful in the identification of the mAb nature, as they confirmed the presence of heavy chains, light chains, and disulfide bonds. IEF showed potential in mAb identification, as clear, partly distinguished patterns of charge variants were obtained. However, some improvements to the pH gradient are needed to enable better separation and pI estimation of basic variants. Determination of molecular size with SEC was found to be difficult, as there seemed to be no consistency between the calculated molecular weights based on measured elution times, and the theoretical molecular weights. Nevertheless, SEC brings added value in mAb quantification and detection of protein aggregation and fragmentation. Finally, RPLC-MS analysis of tryptic peptides resulted in mAb identification, with the measured sequence coverage of 87-97 %. Identification process may be enhanced by focusing on the known CDR-peptides prior the constant frame peptides.
Given the structural similarity of therapeutic mAbs, identification of an unknown mAb requires combination of multiple analytical methods. If available, the use of reference mAb product obtained from a reliable source is recommended, as the identification may be based on comparative analyses using simpler analytical steps, e.g. IEF, SDS-PAGE and SEC. If no reference product is available, identification of the mAb requires peptide mapping and determination of the CRD sequences by RPLC-MS analysis. Further research is needed to find a suitable set of analytical methods for identification of all therapeutic mAbs.
|
| Keyword(s): | terapeuttiset monoklonaaliset vasta-aineet karakterisointi SDS-PAGE isoelektrinen fokusointi peptidi kartoitus therapeutic monoclonal antibodies mAbs characterization SDS-PAGE isoelectric focusing peptide mapping |
Files in this item
| Files | Size | Format | View |
|---|---|---|---|
| Takala_Hanna-Elina_Pro gradu_2020.pdf | 2.483Mb |
This item appears in the following Collection(s)
-
Faculty of Pharmacy [577]