Correcting the causative mutation in Finnish CADASIL patient-derived cell line with CRISPR base editor system
| Title: | Correcting the causative mutation in Finnish CADASIL patient-derived cell line with CRISPR base editor system |
| Author(s): | Keskinen, Timo |
| Contributor: | University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences, Faculty of Biological and Environmental Sciences |
| Degree program: | Master's Programme in Genetics and Molecular Biosciences |
| Specialisation: | Genetics and Genomics |
| Language: | English |
| Acceptance year: | 2020 |
| Abstract: |
CADASIL (Cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy) on autosomaalisesti ja vallitsevasti eli dominantisti ilmenevä sairaus, joka johtaa kognitiivisten kykyjen heikentymiseen, vaskulaariseen dementiaan ja aivoinfarkteihin. Taudissa sileän lihaskudoksen solut rappeutuvat vähitellen ja korvautuvat sidekudoksella aivojen pienten ja keskisuurten valtimoiden ympärillä. Solunulkoiset GOM-kerääntymät (granular osmiophilic material) ympäröivät verisuonten sileitä lihassuoluja ja ovat tyypillinen piirre CADASIL-taudissa. Sairauden taustalla ovat mutaatiot Notch3-geenissä, joka koodaa solujen välisessä signaloinnissa tärkeää transmembraaniproteiinia. Taudin aiheuttavia mutaatioita on löydetty yli 200, joista suurin osa muuttaa kysteiini-aminohappojen lukumäärää. Taudin patologian aiheuttava mekanismi on vielä hämärän peitossa, mutta todennäköisesti patologian kehittymiseen liittyvät GOM-kerääntymät, jotka ovat mahdollisesti myrkyllisiä verisuonten sileille lihassoluille.
Tämän maisterintutkielman tavoitteena oli korjata CADASIL-sairauteen johtava patogeeninen Notch3-geenin mutaatio c.475C>T erilaisilla CRISPR emäseditorisysteemeillä. Toinen tavoite oli luoda iPS-solulinjoja (Induced Pluripotent Stemcell) CADASIL-potilaalta peräisin olevasta ihonäytteestä. Näitä solulinjoja, sekä ohessa valmistettuja CADASIL-korjattuja iPS-linjoja voidaan käyttää tulevaisuudessa CADASIL-tautimallin ja kontrollimallin luomisessa.
RNA:han perustuvaa ABEmax emäseditoria käytettiin CADASIL-mutaation korjaamisessa kuolemattomassa- ja primaarisessa CADASIL-solulinjassa. DNA:han perustuvaa ABEmax emäseditoria käytettiin positiivisena kontrollina. Samanaikainen solujen iPS-induktio sekä patogeenisen CADASIL-mutaation korjaaminen toteutettiin samassa elektroporaatiossa tämän projektin aikana. Editointitehokkuus arvioitiin Sanger-sekvensoimalla editoinnin kohdealue transfektiota ennen ja sen jälkeen.
Editointitehokkuus oli yleisesti hyvä ja vaihteli 27%:sta 73%:in riippuen käytetystä systeemistä, käytetyistä ohjaus-RNA:ista ja elektroporaation parametreista. Varmennettua epäspesifistä editointia ei havaittu editoinnin kohde-emäksen läheisyydessä eikä epäspesifistä editointia arvioitu genominlaajuisesti.
Cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy (CADASIL) is an inherited autosomal dominant disease that leads to cognitive impairment, vascular dementia and ischemic strokes. In CADASIL, vascular smooth muscle cells (VSMCs) degrade gradually and are replaced by connective tissue in the small and mid-sized arteries in the brain. Extracellular granular osmiophilic material (GOM) that surround the VSMCs are a unique feature in CADASIL. The causal gene behind CADASIL is Notch3, which encodes a transmembrane protein with a signaling function. There are over 200 cysteine-altering mutations that cause CADASIL in Notch3. The potential pathology causing mechanism is still unclear, but most likely the mechanism is linked to the aggregation of GOM deposits that are potentially toxic to VSMCs.
This thesis project aimed to correct CADASIL causing c.475C>T mutation in Notch3 in different CADASIL cell lines with different CRISPR base editor systems. Another aim was to create induced pluripotent stem cell (iPSC) lines from a CADASIL patient-derived skin biopsy sample to be used in the creation of an in vitro disease model for CADASIL.
RNA-based ABEmax base editor system was used to correct immortalized- and primary- CADASIL cell lines. DNA-based ABEmax base editor system was used as a positive control. Simultaneous pluripotent reprogramming and pathogenic CADASIL mutation correction were done in the same transfection during this project. The editing efficiencies were evaluated by Sanger sequencing the genomic target region before and after the transfection.
The editing efficiencies were good in general compared to literature. They ranged from 27 % to 73 % target base editing efficiency depending on the editing system-, guide-RNAs - and electroporation parameters used. Confirmed proximal off-target effects were not detected, and distal off-target effects were not evaluated.
|
| Keyword(s): | CADASIL CRISPR iPSC Base editing |
Files in this item
| Files | Size | Format | View |
|---|---|---|---|
| Keskinen_Timo_tutkielma_2020.pdf | 675.2Kb |