Calsyntenin-3 Laminin G-Like Domain Forms Dimers in a Solution
| Title: | Calsyntenin-3 Laminin G-Like Domain Forms Dimers in a Solution |
| Author(s): | Larkiala, Taru |
| Contributor: | University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences |
| Degree program: | Master's Programme in Genetics and Molecular Biosciences |
| Specialisation: | Biochemistry and Structural biology |
| Language: | English |
| Acceptance year: | 2020 |
| Abstract: |
Kalsynteniini-3 on tyypin I kalvoproteiini, jota esiintyy pääasiassa post-synaptisissa solukalvoissa. Se kuuluu kalsynteniinien proteiiniperheeseen, joka on osa kadheriinien superperhettä. Kalsynteniini-3 sisältää solulimanpuoleisen C-terminaalisen osan, kalvon läpäisevän domeenin ja solunulkoisen N-terminaalisen osan, joka sisältää laminiinin G-domeenin tyyppisen -domeenin (LNS) ja kaksi kadheriinidomeenia (CAD). Kalsynteniini-3:a esiintyy pääasiassa aivoissa, mutta sitä on myös sydämessä, maksassa, haimassa, keuhkoissa, lihaksissa ja istukassa. Kalsynteniini-3:lla on vaikutusta neurogeneesiin, sillä se vaikuttaa eksitatoristen ja inhibitoristen synapsien kehitykseen. Sillä voi olla myös vaikutusta Alzheimerin taudin kehittymisessä, koska sen on havaittu pystyvän sitoutumaan β-amyloidipeptidiin, jonka tiedetään olevan avainasemassa Alzheimerin taudin synnyssä.
Kalsynteniini-3 on synaptinen adheesioproteiini, joka sitoutuu postsynaptisiin neureksiineihin solunulkoisella osallaan. Aikaisempien tutkimusten tulokset ovat kuitenkin ristiriidassa keskenään sen suhteen, mikä kalsynteniini-3:n domeeni sitoutuu neureksiineihin. Erimielisyyttä esiintyy myös siitä, sitoutuuko kalsynteniini-3 neureksiini-α:aan, neureksiini-β:aan vai molempiin. Näiden ristiriitojen takia tämän pro gradu -työn tavoitteena oli tuottaa rekombinanttien bakulovirusten avulla hyönteissoluviljelmissä osia kalsynteniini-3:sta siten, että ne sisälsivät joko kalsynteniini-3:n kaksi CAD-domeenia, LNS-domeenin tai kaikki kolme domeenia. Nämä puhdistetut kalsynteniini-3:n osat olisi käytetty kokeissa, joissa olisi määritelty, mitkä kalsynteniini-3:n domeenit sitoutuvat neureksiineihin. Valitettavasti vain kalsynteniini-3:n LNS-domeenin puhdistus onnistui ja CAD-domeeneja sisältävien rakenteiden puhdistus epäonnistui. SEC-MALLS-koe, joka tehtiin kalsynteniini-3:n LNS-domeenille, paljasti, että kalsynteniini-3:n LNS-domeeni muodostaa dimeerejä liuoksessa, mikä on yhdenmukaista sukupuolihormoneja sitovan globuliinin LNS-domeenilla tehtyjen kokeiden kanssa.
Tämän pro gradu -työn toinen tavoite oli ilmentää kalsynteniini-3:n osia HEK293T-solujen pinnalla, ja testata kalsynteniini-3:n ja neureksiinien sitoutumista solun pinnalla tehtävässä sitoutumiskokeessa. Sitoutumiskokeen tulokset viittaavat siihen, että sitoutuminen tapahtuu kalsynteniini-3:n CAD-domeenien avulla, ja että kalsynteniini-3 sitoutuu neureksiini-α:aan, mutta ei neureksiini-β:aan. Sitoutumiskokeen tulokset olivat kuitenkin ristiriitaisia: sitoutumista kalsynteniini-3:n täyspitkän solunulkoisen osan ja neureksiini-α:n välillä ei havaittu, mutta sitoutumista havaittiin pelkän kalsynteniini-3:n CAD-domeenin sisältävän proteiinin ja neureksiini-α:n välillä. Tämän vuoksi solun pinnan sitoutumismääritystä ei voida pitää täysin luotettavana, ja se tulisi toistaa ennen uusien johtopäätösten tekemistä.
Calsyntenin-3 is a type I transmembrane protein, that is mainly expressed on the post-synaptic cell membranes. It belongs to the calsyntenin family that is part of the cadherin superfamily. Calsyntenin-3 consists of a cytosolic C-terminal region, a transmembrane domain and an extracellular N-terminal part, that consists of a laminin G-like domain (LNS) and two cadherin domains (CAD). Calsyntenin-3 is mainly expressed in the brain, but it can also be found in the heart, liver, pancreas, lung, skeletal muscle and placenta. Calsyntenin-3 has an effect on neurogenesis by affecting the development of excitatory and inhibitory synapses. It might also play a role in Alzheimer’s disease, as it has been found to be able to bind β-amyloid peptide, that is known to play a key role in the development of Alzheimer’s disease.
Calsyntenin-3 acts as a synaptic adhesion protein, that binds to the post-synaptic neurexins with its extracellular region. However, the previous studies have contradicting results regarding the calsyntenin-3 domains that mediate the interaction between the calsyntenin-3 and neurexins. There is also disagreement whether calsyntenin-3 binds neurexin-α, neurexin-β or both. Because of these discrepancies, the aim of this master’s thesis study was to produce the calsyntenin-3 ectodomain constructs that contained either the two CAD domains, the LNS domain or all three domains, using baculovirus mediated protein production in insect cell cultures. These purified protein constructs were meant to be used for the determination of the binding domains. Unfortunately, only the purification of the calsyntenin-3 LNS domain was successful and the purification of the constructs, containing the CAD domains, was unsuccessful. A SEC-MALLS experiment, that was performed for the calsyntenin-3 LNS domain, revealed that it forms dimers in a solution, which is consistent with experiments performed with the LNS domain of human sex hormone‐binding globulin.
The second aim of this master’s thesis study was to express the calsyntenin-3 ectodomain constructs on the surface of HEK293T cells and to test the binding between calsyntenin-3 and neurexins in a cell surface binding assay. The results of the cell surface binding assay indicated that the binding is mediated by the calsyntenin-3 CAD domains and that calsyntenin-3 binds to neurexin-α, but the binding to neurexin-β was not detected. However, the results from the cell surface binding assay were conflicting: the binding between the calsyntenin-3 full ectodomain construct and neurexin-α was not detected, but the binding was detected between calsyntenin-3 CAD ectodomain construct and neurexin-α. Therefore, the cell surface binding assay cannot be considered entirely reliable and should be repeated before making further conclusions.
|
| Keyword(s): | Calsyntenin-3 Neurexin LNS domain CAD domain Recombinant baculovirus protein production Sf9 cells High Five cells Cell surface binding assay |
Files in this item
| Files | Size | Format | View |
|---|---|---|---|
| Taru_Larkiala_Pro gradu_2020.pdf | 4.720Mb |