Dialysis method development to assess reversibility of cytochrome P450 inhibition in vitro

Lääkeainemetabolia on useita entsyymivälitteisiä reaktioita sisältävä prosessi, jossa lääkeaineita muokataan paremmin elimistöstä poistuvaan muotoon. Kemialliset yhdisteet, kuten lääkeaineet, voivat vaikuttaa metaboloivien entsyymien aktiivisuuteen, jolloin kyseisen entsyymin kautta metaboloituvan lääkeaineen pitoisuus elimistössä voi kasvaa jopa toksiseksi. Aihiolääkeiden kohdalla sen sijaan voi olla, ettei lääke pääse biologisesti aktiiviseen muotoonsa, eikä näin ollen lääkkeen tehoa saavuteta. Lääketutkimuksessa ja -kehityksessä onkin tärkeää mahdollisimman varhaisessa vaiheessa tunnistaa ja välttää edellä mainittuja tilanteita. Sytokromi P450 (CYP) -entsyymien inhibitio on merkittävimpiä syitä haitallisille lääke-lääkeyhteisvaikutuksille. Inhibitio voi olla ajasta riippuvaa (engl. time dependent inhibition, TDI), jolloin inhibitio voimistuu ajan kuluessa. TDI:ta on sekä palautuvaa että palautumatonta, joista jälkimmäinen on usein haitallisinta, sillä entsyymin toiminnan palautuminen vaatii uusien entsyymien syntetisoinnin. Yhdisteiden taipumusta aiheuttaa TDI:ta voidaan tutkia IC50 siirtymämenetelmällä, mutta se ei kerro, onko inhibitio palautuvaa vai palautumatonta. Tätä on kuitenkin mahdollista tutkia jatkokokeilla, kuten dialyysimenetelmällä. Mikäli tutkittava yhdiste on sitoutunut entsyymiin irreversiibelisti, entsyymiaktiivisuus ei palaudu dialyysin aikana. Tämän työn tarkoituksena oli kehittää Orion Pharman käyttöön dialyysimenetelmä, jolla pystyttäisiin tutkimaan IC50-siirtymäkokeessa havaitun ajasta riippuvaisen inhibition palautuvuutta. Mikrosomeilla suoritettava menetelmä on esitetty aiemmin kirjallisuudessa. Työn aikana dialyysimenetelmää testattiin neljän eri CYP-isoformin tunnetuilla inhibiittoreilla (sekä ajasta riippuvia että suoria inhibiittoreita): CYP1A2 (furafylliini ja fluvoksamiini), CYP2C9 (tieniilihappo ja sulfafenatsoli), CYP2D6 (paroksetiini ja kinidiini) ja CYP3A4 (verapamiili, atsamuliini ja ketokonatsoli). Työssä esitetty dialyysimenetelmä toimi tutkituilla lääkeaineilla pääosin kuten kirjallisuuden perusteella saattoi odottaa. Työnkulku IC50-siirtymäkokeesta dialyysimenetelmään oli toimiva, ja IC50-siirtymäkokeesta saatua dataa voitiin hyödyntää dialyysikokeen konsentraatioita valittaessa. Sekä IC50-siirtymäkoe että dialyysikoe tuottivat toistettavia tuloksia ja replikaattien sekä eri koepäivien väliset hajonnat olivat suhteellisen pieniä. Dialyysimenetelmä vaatii vielä optimointia, mutta tähänastiset tulokset vaikuttavat lupaavilta. Tulevaisuudessa menetelmä saattaa olla osana in vitro CYP-inhibitiotutkimuksia Orion Pharmalla.