Establishing a synaptic assay to model the genetic risk of schizophrenia in iPSC-derived neurons
| Title: | Establishing a synaptic assay to model the genetic risk of schizophrenia in iPSC-derived neurons |
| Author(s): | Karmila, Nelli |
| Contributor: | University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences |
| Degree program: | Master's Programme in Genetics and Molecular Biosciences |
| Specialisation: | Genetics and genomics |
| Language: | English |
| Acceptance year: | 2022 |
| Abstract: |
Skitsofrenia on vakava psykiatrinen sairaus, jolla on haitallisia vaikutuksia potilaan elämän laatuun. Skitsofreniaan liittyy alentunut elinajanodote ja kohonnut itsemurhariski, minkä takia uusia hoitoja kaivataan kipeästi. Biologista mekanismia skitsofrenian taustalla ei ole vielä selvitetty, mutta useat tutkimustulokset viittaavat keskushermostoon, hermosoluihin ja synapseihin. Dendriittien vastaanottavien rakenteiden (eng. dendritic spine) tiheyden lasku ja yliaktiivinen synapsien karsiminen (eng. synaptic pruning) ovat linkitetty skitsofreniaan. Geneettiset tutkimukset tukevat hermosolujen ja synapsien osuutta skitsofreniassa. Sopiva mallisysteemi on ensisijaisen tärkeä, jotta skitsofrenian biologista mekanismia voidaan tutkia.
Indusoitu pluripotentti kantasolu (induced pluripotent stem cell, iPSC) -teknologia tarjoaa menetelmän skitsofrenian mallintamiseen. Somaattiset solut, kuten fibroblastit, voidaan ohjelmoida takaisin pluripotenttiin tilaan, joka muistuttaa alkion kantasolujen tilaa. Nämä solut on mahdollista erilaistaa miksi tahansa ihmisen kudoksien solutyypiksi, jotka eivät muutoin olisi saatavilla. Tämä mahdollistaa hermosolukulttuurien perustamisen potilaista ja terveistä verrokeista. Näiden solukulttuurien tutkiminen mahdollistaa biologisten erojen havaitsemisen potilaiden ja terveiden yksilöiden välillä. Skitsofreniatutkimus on alana ottanut iPSC teknologian käyttöön, ja useita tutkimuksia käyttäen kyseistä teknologiaa on tehty. Muun muassa synapsien tiheyttä on tutkittu erilaistetuissa hermosolukulttuureissa. Näissä tutkimuksissa alentunut synapsitiheys on yhdistetty skitsofreniaan.
Tässä tutkielmassa käytettiin muokattua versiota Nehme ym. (2018) protokollasta iPS-solujen erilaistamiseen hermosoluiksi yhteisviljelmissä iPSC-peräisten ihmisen astrosyyttien kanssa. Päällimmäinen tavoite oli luoda vasta-ainevärjäykseen perustuva synapsitiheyden määritysmenetelmä. Ensimmäiseksi vasta-ainevärjäykseen sopivia merkkiproteiineja ja niihin sitoutuvia vasta-aineita testattiin ja parhaiten työn tarkoitukseen sopivat valittiin. Tunnusmerkkinä toimivien proteiinien ja niihin sitoutuvien vasta-aineiden tehtävä oli varmistaa hermosolujen identiteetti, kypsyys ja merkitä synapsit. Seuraavaksi solujen viljelyolosuhteet optimoitiin testaamalla eri solutiheyksiä ja kaivojen päällystysmateriaaleja. Lopuksi rakennettu menetelmä testattiin kolmella solulinjalla (terve verrokki ja samamunaiset kaksoset, joista toisella diagnosoitu skitsofrenia), jotka erilaistettiin hermosoluiksi yhteisviljelmissä astrosyyttien kanssa. Erilaistuneet hermosolut karakterisoitiin vasta-ainevärjäyksillä, joissa käytettiin valittuja vasta-aineita ja kuva-analyysi ohjelmia. Synapsien tiheys laskettiin solulinjoille. Menetelmää arvioitiin analysoimalla varianssia (Analysis of variance; ANOVA) ja käyttämällä rajoitetun suurimman uskottavuuden mallinnusta (restricted maximum likelihood model; RELM).
Tässä työssä rakennettiin synapsien tiheyttä 2D-kulttuurissa mittaava menetelmä. Synapsien tiheyden keskiarvo oli kaikissa solulinjoissa noin 1 synapsi per 100μm neuriittia. Menetelmän tuottamasta datasta paljastui selkeä vaihtelu erien välillä sekä teknistä variaatiota. Näistä syistä menetelmä tarvitsee vielä hiomista ja optimointia, jotta ei-toivottu variaatio saataisiin minimiin. Menetelmän testauksen perusteella vaikuttaisi myös siltä, että erot synapsien tiheydessä potilaista ja verrokeista perustetuissa kulttuureissa ovat vähäisiä. Tämän vuoksi kohinaa tulee vähentää, jotta oikea signaali ei hautaudu sen alle. Suurempi otoskoko tarvitaan toteamaan erojen todellinen suuruus. Näiden tulosten perusteella voidaan kuitenkin sanoa, että metodologiaan on syytä kiinnittää huomiota iPSC teknologiaa hyödyntävissä tutkimuksissa.
Schizophrenia is a debilitating psychiatric disorder associated with reduced life expectancy. The biological mechanism of schizophrenia is nebulous; however, many findings point to the central nervous system and neurons, where a reduction in dendritic spines has been indicated by previous research. The genetic findings support the involvement of synapses in the pathogenesis of schizophrenia. To study the biological properties stemming from genetics, relevant model systems and efficient methods are needed.
Induced pluripotent stem cell (iPSC) technology offers a robust method for modeling the biological processes underlying schizophrenia. Somatic cells, e.g. fibroblasts, can be reprogrammed back to a pluripotent state resembling embryonic stem cells, and further differentiated into any cell type of the body, which might not be otherwise accessible. This allows establishing and characterizing neuronal cultures from patient and control cell lines, potentially revealing biological differences associated to the disease phenotype. The field of schizophrenia research has adopted iPSC technology and multiple studies have been conducted. These include assessments of synaptic density in the produced neuronal cultures, many of which reported decreased density associated with schizophrenia.
In this thesis, a modified version of Nehme et al. (2018) protocol was used to differentiate iPSCs into neurons in co-cultures with human iPSC-derived astrocytes. The overarching aim was to construct an immunocytochemistry (ICC) -based assay to measure synaptic density in the produced co-cultures. First, suitable markers for characterization by ICC were tested and selected. The markers were selected to inform about neuronal identity, maturity, and synapses of the differentiated neurons. Next, the culturing conditions were optimized regarding the cell density and coating of the culturing wells. Finally, to estimate the utility of the assay, a pilot study was performed with three cell lines derived from a healthy control and a monozygotic twin pair discordant for schizophrenia. iPSCs from these cell lines were differentiated into neurons in co-cultures with astrocytes, and then characterized with ICC using selected markers and image analysis software. The synaptic density was quantified for each cell line. The performance of the assay was evaluated with analysis of variance (ANOVA) and restricted maximum likelihood model (RELM).
An assay to quantify synaptic structures in mature neurons was established. The average synaptic density for all cell lines was approximately 1 synapse per 100μm of neurite. Analysis of the data produced with the assay revealed a notable batch effect and technical variation. This suggests that further optimization is needed to reduce variance from undesired sources. The pilot data suggests that the differences in synaptic density between cases and controls may be modest, further highlighting the need for minimizing noise in the assay to improve signal to noise ratio. However, indicated by power analysis, large sample sizes are needed to identify meaningful differences between cases and controls. In light of these results, more attention should be drawn to the methodology in the field of iPSC-based studies, as the principals of the assay constructed here were similar to other synaptic assays used in previous publications.
|
| Keyword(s): | schizophrenia iPSC immunocytochemistry neuron synapse cellculture NGN2 |
Files in this item
| Files | Size | Format | View |
|---|---|---|---|
| Karmila_Nelli_Thesis_2022.pdf | 2.062Mb |