SLCO1B1- geenimutaatioiden vaikutus OATP1B1-transportterin toimintaan, ekspressioon ja lokalisaatioon in vitro
| Title: | SLCO1B1- geenimutaatioiden vaikutus OATP1B1-transportterin toimintaan, ekspressioon ja lokalisaatioon in vitro |
| Author(s): | Jaakkonen, Liina |
| Contributor: | University of Helsinki, Faculty of Pharmacy |
| Degree program: | Master 's Programme in Pharmacy |
| Specialisation: | Biopharmaceutics |
| Language: | Finnish |
| Acceptance year: | 2022 |
| Abstract: |
OATP1B1 on pääasiassa maksassa ilmentyvä influksitransportteri, joka kuljettaa monia kliinisesti tärkeitä endogeenisia aineita sekä lääkeaineita porttilaskimon verestä maksasoluihin. OATP1B1-transportterin välitteinen soluunotto määrittää substraattilääkkeiden eliminaationopeuden maksassa vaikuttaen suoraan niiden plasmapitoisuuksiin. OATP1B1-transportteria koodaavassa SLCO1B1-geenissä luontaisesti esiintyvät yhden nukleotidin polymorfiat (pistemutaatiot) voivat muuttaa transportterin toimintaa ja sitä kautta vaikuttaa substraattilääkkeiden farmakokinetiikkaan, tehoon ja toksisuuteen. Tämän pro gradu- tutkielman tavoitteena oli tutkia neljän luontaisesti esiintyvän SLCO1B1-geenin pistemutaation vaikutusta OATP1B1-transportterin kuljetusaktiivisuuteen, ekspressioon ja lokalisaatioon in vitro.
Pistemutaatiot 170G>A (R57Q), 388A>G (N130D), 452A>G (N151S) ja 758G>A (R253Q) tuotettiin pENTR221-plasmidissa olevaan SLCO1B1-geeniin kohdennetun mutageneesin avulla. Bac-to-Bac® Bakulovirusekspressiomenetelmän avulla Sf9-soluissa tuotettiin rekombinantti-bakuloviruksia, joilla transduktoitiin HEK293-solut OATP1B1-villityypin ja varianttiproteiinien ilmentämiseksi. Soluunottokokeen avulla tutkittiin OATP1B1-varianttien kuljetusaktiivisuutta HEK293-soluissa. Western blot- menetelmän avulla tutkittiin OATP1B1-proteiiniekspressiota solukalvovesikkeleissä ja immunofluoresenssivärjäyksen avulla selvitettiin OATP1B1-villityypin ja varianttien lokalisaatio HEK293-soluissa.
Varianttien R57Q ja R253Q kuljetusaktiivisuus laski tilastollisesti merkittävästi verrattuna villityyppiin. Varianttien N130D ja N151S kuljetusaktiivisuus ei puolestaan merkittävästi eronnut villityypistä. Kuljetusaktiivisuuden muutosten syitä ei voitu luotettavasti arvioida, koska OATP1B1-proteiinien ekspressiotason määritys Western blotin avulla epäonnistui. Immunofluoresenssimikroskoopilla kuitenkin havaittiin, että kaikkien tutkittujen varianttiproteiinien lokalisaatio ja ekspressio bakuloviruksilla transduktoiduissa HEK293-soluissa oli verrattavissa villityyppiin.
Tämän pro gradun tulokset viittaavat siihen, että pistemutaatiot 170G>A ja 758G>A voivat laskea OATP1B1-transportterin kuljetusaktiivisuutta ja substraattien soluunottoa in vitro. Tutkimustulosten vahvistamiseksi tarvitaan lisää in vitro tutkimuksia varianttien R57Q ja R253Q kuljetusaktiivisuudesta, ekspressiosta ja lokalisaatiosta. Jatkossa pitäisi myös tutkia näiden varianttien kliinistä merkitystä substraattilääkkeiden farmakokinetiikassa ja -dynamiikassa, koska 170G>A ja 758G>A pistemutaatiot saattavat lisätä OATP1B1-substraattilääkkeiden altistuksia ja haittavaikutusriskiä.
OATP1B1 is an influx transporter that is predominantly expressed in the liver, and it mediates the uptake of many clinically important endogenous compounds and drugs from portal vein blood into hepatocytes. OATP1B1-mediated uptake affects the rate of hepatic elimination of substrate drugs, directly affecting their plasma concentrations. Some naturally occurring single nucleotide variants (SNVs) in the SLCO1B1 gene encoding OATP1B1 can alter the transport function of the transporter resulting in alterations in pharmacokinetics, efficiency and toxicity of substrate drugs. The aim of this master´s thesis was to examine the effect of four naturally occurring SNVs of the SLCO1B1 gene on transport activity, expression, and localization of the OATP1B1 transporter in vitro.
SNVs 170G>A (R57Q), 388A>G (N130D), 452A>G (N151S) and 758G>A (R253Q) were created using site-directed mutagenesis in the SLCO1B1 gene presenting in the pENTR221 plasmid. Recombinante baculoviruses were produced in Sf9 cells using the Bac-to-Bac® Baculovirus Expression System and used to transduce HEK293 cells for the overexpression of OATP1B1 wild type and variant proteins. An uptake assay was used to study the transport activity of the OATP1B1 variants in HEK293 cells. Western blotting was used to study the expression of OATP1B1 proteins in membrane vesicles. Immunofluorescence staining was used to determine the localization of OATP1B1 wild type and variants in HEK293 cells.
Transport activity of the OATP1B1 variants R57Q and R253Q was significantly decreased compared to wild type. In contrast, transport activity of the N130D ja N151S variants was not significantly altered. The reasons for the changes in transport activity could not be reliably estimated due to the failure to measure the expression levels of OATP1B1 proteins by Western blotting. However, immunofluorescence microscopy revealed that the localization and expression of the all the studied OATP1B1 in baculovirus transduced HEK293 cells were comparable to the wild type.
The results of this master´s thesis indicate that SNVs 170G>A and 758G>A can impair the transport activity and substrate uptake functions of OATP1B1 in vitro. Additional in vitro studies of transport activity, expression and localization of the variants R57Q and R253Q will be required to confirm these results. In the future, the R57Q and R253Q variants should be also studied for their possible clinical significance in pharmacokinetics and pharmacodynamics of substrate drugs, as SNVs 170G>A and 758G>A may increase the exposure and the risk for adverse effects of OATP1B1 substrate drugs.
|
| Keyword(s): | SLCO1B1 OATP1B1 transportteri pistemutaatio aminohappomuutos kuljetusaktiivisuus proteiiniekspressio lokalisaatio |
Files in this item
| Files | Size | Format | View |
|---|---|---|---|
| Jaakkonen_Liina_tutkielma_2022.pdf | 1.113Mb |
This item appears in the following Collection(s)
-
Faculty of Pharmacy [572]