Regulation of Gene Expression at Posttranscriptional Level by Engineered Cas13 System In Vitro

Suuresta tarpeesta huolimatta, ei työvälineitä geeniekspression endogeeniseen säätelyyn ole nykypäivänä tarjolla lääketieteellisiin eikä tutkimuksellisiinkaan tarkoituksiin. Vuonna 2017 karakterisoitiin uuden CRISPR-Cas tyypin VI kompleksit. Nämä kompleksit hyödyntävät endonukleaasiaktiivisuudessaan uudenlaista Cas13 -efektoria, jonka kohteena toimii yksijuosteiset RNA-molekyylit. Cas13 tunnistaa kohteensa opas-RNA:n (gRNA) avulla. Tätä komplementaarisuutta hyödyntämällä on onnistuttu kohdistamaan Cas13:n aktiivisuus spesifisiin lähetti-RNA molekyyleihin nisäkässolukokeissa ilman kohde-RNA:n ulkopuolisia hajoamistuotteita. Tämän lisäksi nukleaasiinaktivoituja Cas13 efektoreita (dCas13) on käytetty esimerkiksi kohdennettuun nukleotidien deaminaatioon ja vaihtoehtoisen silmikoinnin indusointiin. Tämä todistaa dCas13 efektorien kyvyn toimia ohjelmoitavina apuproteiineina, joiden avulla voidaan ohjata kompleksiin liitetyn proteiinin toiminta spesifisille kohde-RNA:n alueille. Tässä tutkimuksessa, kaksi eukaryoottien translaatioon osallistuvaa proteiinia, ELAVL1 ja EIF4E, yhdistettiin dCas13b efektorin kanssa C- ja N-terminaalisesti, tarkoituksena lisätä kohteena olevan lähetti-RNA:n ekspressiota parantamalla tämän translatiivisuutta tai stabiliteettia. Koeasetelmassa vertailtiin näiden neljän fuusioproteiinin sekä aktiivisen Cas13b:n vaikutusta lusiferaasin ekspressioon käyttäen kuutta eri gRNA:ta aktivaation ohjaamisessa. Kokeet suoritettiin in vitro ympäristössä HEK293T-soluissa. Natiivi Cas13b vähensi merkittävästi lusiferaasisignaalia, kun taas samassa asetelmassa C-terminaalinen dCas13b-ELAVL1 fuusio lisäsi tätä tilastollisesti merkittävästi eli aikaansai kasvaneen lusiferaasiekspression. Vastaavaa vaikutusta ei ollut havaittavissa muissa fuusioproteiineissa. Tulokset todistavat onnistuneen Cas13b-välitteisen degradaation, sekä dCas13bELAVL1-välitteisen lisääntyneen lusiferaasitranskriptin translaation. Jatkotutkimusta vaaditaan fuusioproteiinin toiminnallisuuden ja varsinaisen kohteen ulkopuolisen aktiivisuuden määrityksessä. Siitä huolimatta tutkimuksessa esitelty fuusoproteiinikonstrukti voisi hyvin olla toimiva työkalu geeniekspression spesifin lisäyksen mahdollistamisessa endogeenisessa kontekstissa

Currently, there are no ways to endogenously upregulate gene expression for research purposes or to treat genetic disorders. In 2017, a new type of CRISPR-Cas complexes, type VI, was characterized. These complexes include a new effector, Cas13, which targets and binds single stranded RNA molecules, via guide RNA (gRNA) mediated complementarity. These effectors have been used to target and degrade specific mRNAs with close to no off targets in mammalian cell experiments. Furthermore, nuclease dead versions of the effectors have been used to guide deamination and alternative splicing of mRNAs, proving that they can also be used in fusion with other proteins to guide specific enzymatic activity. In this study, an engineered version of dCas13b was fused both N- and C-terminally with elF4E and ELAVL1, two eukaryotic proteins involved in translational regulation, in order to increase the stability and translatability of target mRNAs. These fusion constructs were, in tandem with an active Cas13b construct, cotransfected with reporter plasmid containing the gene for firefly luciferase, in order to target the luciferase mRNA in vitro in 293T human embryonic kidney cells. The cells were transfected in 96-well plate format and read via plate reader in a single luciferase assay. The results show decreased luminescence signal with the active Cas13b and increased luminescence signal when targeted with the C-terminal fusion of dCas13b-ELAVL1, when compared against non-targeting gRNA controls. The other dCas13b fusions show no effect in luminescence. These results suggest, both a successful degradation and knockdown of the luciferase transcript with the active Cas13b, as well as a successful knock up of luciferase transcript expression with C-terminal ELAVL1 fused with dCas13b. Further research and analysis are needed to determine the function and possible off targets, but in theory this novel fusion protein construct could be used for specific knock up of genes in their endogenous context