Regulation of Gene Expression at Posttranscriptional Level by Engineered Cas13 System In Vitro
Title: | Regulation of Gene Expression at Posttranscriptional Level by Engineered Cas13 System In Vitro |
Author(s): | Hietanen, Sakari |
Contributor: | University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences |
Degree program: | Master's Programme in Genetics and Molecular Biosciences |
Specialisation: | Molecular and Analytical Health Biosciences |
Language: | English |
Acceptance year: | 2022 |
Abstract: |
Suuresta tarpeesta huolimatta, ei työvälineitä geeniekspression endogeeniseen säätelyyn ole nykypäivänä tarjolla
lääketieteellisiin eikä tutkimuksellisiinkaan tarkoituksiin. Vuonna 2017 karakterisoitiin uuden CRISPR-Cas tyypin
VI kompleksit. Nämä kompleksit hyödyntävät endonukleaasiaktiivisuudessaan uudenlaista Cas13 -efektoria, jonka
kohteena toimii yksijuosteiset RNA-molekyylit. Cas13 tunnistaa kohteensa opas-RNA:n (gRNA) avulla. Tätä
komplementaarisuutta hyödyntämällä on onnistuttu kohdistamaan Cas13:n aktiivisuus spesifisiin lähetti-RNA
molekyyleihin nisäkässolukokeissa ilman kohde-RNA:n ulkopuolisia hajoamistuotteita. Tämän lisäksi nukleaasiinaktivoituja Cas13 efektoreita (dCas13) on käytetty esimerkiksi kohdennettuun nukleotidien deaminaatioon ja
vaihtoehtoisen silmikoinnin indusointiin. Tämä todistaa dCas13 efektorien kyvyn toimia ohjelmoitavina
apuproteiineina, joiden avulla voidaan ohjata kompleksiin liitetyn proteiinin toiminta spesifisille kohde-RNA:n
alueille.
Tässä tutkimuksessa, kaksi eukaryoottien translaatioon osallistuvaa proteiinia, ELAVL1 ja EIF4E,
yhdistettiin dCas13b efektorin kanssa C- ja N-terminaalisesti, tarkoituksena lisätä kohteena olevan lähetti-RNA:n
ekspressiota parantamalla tämän translatiivisuutta tai stabiliteettia. Koeasetelmassa vertailtiin näiden neljän
fuusioproteiinin sekä aktiivisen Cas13b:n vaikutusta lusiferaasin ekspressioon käyttäen kuutta eri gRNA:ta
aktivaation ohjaamisessa. Kokeet suoritettiin in vitro ympäristössä HEK293T-soluissa. Natiivi Cas13b vähensi
merkittävästi lusiferaasisignaalia, kun taas samassa asetelmassa C-terminaalinen dCas13b-ELAVL1 fuusio lisäsi tätä
tilastollisesti merkittävästi eli aikaansai kasvaneen lusiferaasiekspression. Vastaavaa vaikutusta ei ollut havaittavissa
muissa fuusioproteiineissa. Tulokset todistavat onnistuneen Cas13b-välitteisen degradaation, sekä dCas13bELAVL1-välitteisen lisääntyneen lusiferaasitranskriptin translaation. Jatkotutkimusta vaaditaan fuusioproteiinin
toiminnallisuuden ja varsinaisen kohteen ulkopuolisen aktiivisuuden määrityksessä. Siitä huolimatta tutkimuksessa
esitelty fuusoproteiinikonstrukti voisi hyvin olla toimiva työkalu geeniekspression spesifin lisäyksen
mahdollistamisessa endogeenisessa kontekstissa
Currently, there are no ways to endogenously upregulate gene expression for research purposes or to treat genetic
disorders. In 2017, a new type of CRISPR-Cas complexes, type VI, was characterized. These complexes include a
new effector, Cas13, which targets and binds single stranded RNA molecules, via guide RNA (gRNA) mediated
complementarity. These effectors have been used to target and degrade specific mRNAs with close to no off targets
in mammalian cell experiments. Furthermore, nuclease dead versions of the effectors have been used to guide
deamination and alternative splicing of mRNAs, proving that they can also be used in fusion with other proteins to
guide specific enzymatic activity.
In this study, an engineered version of dCas13b was fused both N- and C-terminally with elF4E and
ELAVL1, two eukaryotic proteins involved in translational regulation, in order to increase the stability and
translatability of target mRNAs. These fusion constructs were, in tandem with an active Cas13b construct, cotransfected with reporter plasmid containing the gene for firefly luciferase, in order to target the luciferase mRNA in
vitro in 293T human embryonic kidney cells. The cells were transfected in 96-well plate format and read via plate
reader in a single luciferase assay. The results show decreased luminescence signal with the active Cas13b and
increased luminescence signal when targeted with the C-terminal fusion of dCas13b-ELAVL1, when compared
against non-targeting gRNA controls. The other dCas13b fusions show no effect in luminescence. These results
suggest, both a successful degradation and knockdown of the luciferase transcript with the active Cas13b, as well as
a successful knock up of luciferase transcript expression with C-terminal ELAVL1 fused with dCas13b. Further
research and analysis are needed to determine the function and possible off targets, but in theory this novel fusion
protein construct could be used for specific knock up of genes in their endogenous context
|
Keyword(s): | CRISPR-Cas13 ELAVL1 EIF4E CRISPR-Cas dCas13 Cas13 Reporter system Luciferase |
Files in this item
Files | Size | Format | View |
---|---|---|---|
Regulation of G ... Cas13 System In Vitro.pdf | 948.0Kb |