Assessment of the neuroprotective effects of AAV1 mediated MANF gene therapy in a SOD1-G93A mouse model of ALS
| Title: | Assessment of the neuroprotective effects of AAV1 mediated MANF gene therapy in a SOD1-G93A mouse model of ALS |
| Author(s): | Toissalo, Emilia |
| Contributor: | University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences |
| Degree program: | Master 's Programme in Neuroscience |
| Specialisation: | Neuroscience |
| Language: | English |
| Acceptance year: | 2022 |
| Abstract: |
Amyotrofinen lateraaliskleroosi (ALS) on liikehermoja tuhoava sairaus, joka johtaa lihasten surkastumiseen ja lähes täydelliseen halvaantumiseen, sekä lopulta kuolemaan tyypillisesti 2–4 vuoden jälkeen diagnoosista. Tämänhetkiset hoitokeinot voivat pidentää elinaikaa vain muutamilla kuukausilla, jonka takia on tärkeää kehittää aiempaa tehokkaampia lääkkeitä. Mesenkefaalinen astrosyyttiperäinen hermokasvutekijä (MANF) on evolutionaarisesti konservoitunut hermokasvutekijä, jonka toimintamekanismi eroaa tavallisista hermokasvutekijöistä. MANF lokalisoituu pääasiassa endoplasmiseen retikulumiin (ER), mutta sen solusta ulos erityksen on havaittu lisääntyvän ER stressin vaikutuksesta ja sen on osoitettu suojelevan soluja ER stressin aiheuttamalta solukuolemalta. MANF:ia on tutkittu Parkinsonin taudin sekä aivohalvauksen tautimalleilla, joissa sillä on havaittu olevan hermosoluja suojelevia sekä niiden toimintaa palauttavia ominaisuuksia. Adeno-assosioitujen virus (AAV) -vektorien avulla terapeuttisia geenejä voidaan viedä ja niitä voidaan ilmentää kohdesoluissa useiden kuukausien ajan, joka vähentää tarvetta jatkuvalle lääkkeiden annostelulle.
Tämän maisteritutkielma projektin tavoitteena oli tutkia intratekaalisesti injektoidun AAV1-MANF geeniterapian vaikutuksia ALS:n SOD1-G93A hiirimallissa. Käytimme normaalin MANF geenin lisäksi MANF geeniä, josta oli poistettu ER palautussignaali (MANF-d), joka muuttaa MANF:in ainoastaan solusta ulos eritettäväksi proteiiniksi. Tavoitteena oli tutkia vaikuttaako tämä modifikaatio MANF:in hermosoluja suojaaviin ominaisuuksiin. Käytimme kontrollina punaista fluoresoivaa proteiinia (RFP), joka oli pakattu AAV1-vektoriin. AAV1-RFP:tä käytettiin myös tutkimaan AAV1-vektorin transduktio ja ekspressio tehokkuutta. Intratekaalinen injektio suoritettiin kertaluontoisesti juuri ennen taudin oireiden ilmaantumista, hiirten ollessa 13 viikon ikäisiä. Hiirten kliinisten oireiden ilmaantumista seurattiin ja hiirille suoritettiin motorista suoriutumista mittaavia käyttäytymiskokeita kerran viikossa. Hiiret lopetettiin oireiden perusteella samassa päätepisteessä, kun ne olivat kykenemättömiä käyttämään takajalkojaan liikkumiseen. Immunohistokemiallisilla värjäyksillä tutkittiin motoneuronien määrää, mikrogliasolujen aktiivisuutta ja RFP:n ilmentymistä selkäytimen lannerangan alueelta otetuista parafiininäytteistä.
Viikon kuluttua injektiosta SOD1-G93A hiirten motorisen suoriutumisen havaittiin olevan parempi sekä AAV1-MANF että AAV1-MANF-d geeniterapiaa saaneilla hiirillä verrattuna kontrolliryhmään. Motorinen suoriutuminen parani tilastollisesti merkitsevästi ”static rods” testissä, jossa MANF ryhmien välillä ei kuitenkaan havaittu eroavaisuuksia. Muissa käyttäytymiskokeissa ei havaittu tilastollisesti merkitseviä eroja ryhmien välillä, mutta viikon 16 ”rotarod” testissä havaittiin huomattava ero AAV1-MANF ja kontrolliryhmän välillä. Tilastollisesti merkitseviä eroja ei havaittu myöskään hiirten selviytymisajoissa, kliinisten oireiden etenemisessä, motoneuronien määrässä tai mikrogliasolujen aktivaatiossa ryhmien välillä. RFP:n havaittiin ilmentyvän pääasiassa lannerangan alueen selkäytimen ventraalisessa osassa. Alustavat tuloksemme osoittavat AAV1-MANF geeniterapian olevan potentiaalinen hoitokeino ALS:iin ja tämä antaa edellytykset tarkemmille tutkimuksille eri eläinmalleilla sekä tutkimusasetelmilla. Tämän lisäksi osoitimme, että intratekaalisesti injektoitu AAV1-MANF geeniterapia oli hyvin siedetty.
Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease characterized by selective loss of upper and lower motor neurons (MN), which causes progressive muscle weakness and paralysis. ALS leads to death typically from 2 to 4 years after diagnosis. It is important to find more effective treatment options for this devastating disease, as the current treatments can prolong the survival by only a few months. Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF) belongs to an evolutionary conserved neurotrophic factor (NTF) family, whose mode of action differs from classical NTFs. MANF is an endoplasmic reticulum (ER) resident protein and is secreted upon ER stress from the ER, and it can protect the cells from ER stress-induced cell death. MANF has shown to be neuroprotective and –restorative in Parkinson’s disease and stroke rodent models. Adeno-associated viral (AAV) vectors can be used to express therapeutic genes in the target tissues for several months, which lessens the need for repetitive dosing.
In this master’s thesis project, we aimed to investigate the neuroprotective effects of intrathecally injected AAV1-MANF gene therapy in a SOD1-G93A mouse model of ALS. We used two different MANF genes; full-length MANF and MANF with deleted ER retention signal (MANF-d), to assess the differences between normal and only secreted MANF. Red fluorescent protein (RFP) was used as a control and to further evaluate the transduction and expression of the viral vectors. Intrathecal injections were performed once on 13 weeks old mice, just before the disease onset. Clinical symptom analyses together with a set of behavioral tests were conducted once a week. Mice were sacrificed at the endpoint of the study when they could no longer use their hind limbs for forwarding propulsion. Immunohistochemical staining was performed on spinal cord paraffin samples, where MN count, microglia activation, and RFP expression were evaluated.
AAV1-MANF and AAV1-MANF-d treatments improved the motor behavior of the SOD1-G93A mice one-week post- injection. More specifically, a statistically significant difference was seen in the turning times in the static rods test on two different diameter rods compared to control, but there was no difference between MANF groups. In addition, there was a notable difference between AAV1-MANF and the control group on week 16 rotarod scores. There were no statistically significant differences in other tests, survival of the mice, MN counts, or microglia activation between the groups. RFP expression was detected mainly in the ventral areas of the spinal cord with immunohistochemistry. Our results indicate the potential of MANF gene therapy in the treatment of ALS. Furthermore, we showed that intrathecal AAV1-MANF injections were well tolerated.
|
| Keyword(s): | Amyotrophic later sclerosis (ALS) SOD1-G93A mouse model motor neuron (MN) mesencephalic astrocyte- derived neurotrophic factor (MANF) adeno-associated viral (AAV) vector |
Files in this item
| Files | Size | Format | View |
|---|---|---|---|
| Master's Thesis, Emilia Toissalo.pdf | 1.041Mb |