Measurement repeatability of flow cytometry and nanoparticle tracking analysis for optimization of extracellular vesicle analysis
| Title: | Measurement repeatability of flow cytometry and nanoparticle tracking analysis for optimization of extracellular vesicle analysis |
| Author(s): | Stendahl, Annie |
| Contributor: | University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences |
| Degree program: | Master's Programme in Genetics and Molecular Biosciences |
| Specialisation: | Molecular and Analytical Health Biosciences |
| Language: | English |
| Acceptance year: | 2022 |
| Abstract: |
Abstract
Faculty: Faculty of Biological and Environmental Sciences
Degree programme: Genetics and Molecular Biosciences
Study track: Molecular and Analytical Health Biosciences
Author: Annie Stendahl
Title: Measurement repeatability of flow cytometry and nanoparticle tracking analysis for optimization of extracellular vesicle measurements
Level: Master’s thesis
Month and year: 11/2022
Number of pages: 92
Keywords: extracellular vesicles, repeatability measurements, metrology, traceability, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, reference material, METVES
Supervisor or supervisors: Virpi Korpelainen, Katariina Maaninka and Pia Siljander
Collaborative partner: VTT Technical Research Centre of Finland Ltd.
Where deposited: E-thesis
Extracellular vesicles (EVs) are lipid bilayer-enclosed vesicles secreted by all cells, containing variable cargo from nucleic acids and proteins to carbohydrates, metabolites, and lipids. EVs are considered to be involved in many physiological and pathological cell functions. Due to their presence in biofluids hence enabling semi-invasive liquid biopsies, EVs have indicated great promise for utilization as biomarkers in clinical settings. The innate properties of EVs and their cargo could also be harnessed into therapeutic use. However, the current methods and reference materials for determining EV concentration and size have not yet achieved the metrological level of repeatability and traceability, which is needed for EV measurements to be utilized in clinical settings.
The aim of this thesis project was to evaluate repeatability of the methods typically used for EV quantification and size determination, flow cytometry (FCM) and nanoparticle tracking analysis (NTA). The repeatability was analyzed with reference material made of hollow organosilica beads and biological EV test samples, both developed in an ongoing EU metrology-project METVES II for EVs. A similar biological EV test sample was also prepared as part of the thesis project. Finally, the repeatability measurements were conducted with calibration beads recommended by the instrument manufacturers. The calibration beads gave repeatable results with FCM and one of the two NTA instruments tested, but neither the reference beads nor the biological EV test samples produced repeatable results to enable determination of repeatability. However, valuable understanding was gained on what can be optimized during the measurements and operation of the instruments to generate more repeatable results with FCM and NTA in EV analysis.
Prior knowledge of both the sample type and method used for measuring would enable optimization of the measurement and instrument operation. Whether the aim is EV quantification or size determination, instrument errors and bias could then be minimized by adjusting the settings according to sample type. Furthermore, EV quantification and size determination would benefit from combining different methods to ensure more reliable and repeatable results. It is clear that more research needs to be done, for i.e., the tested reference beads need to be further developed to be established as EV reference material and enabling standardization of EV measurements. Standardizing EV quantification and size determination is required to achieve metrological repeatability and ultimately, traceability, and thus for EVs to be utilized in clinical settings as biomarkers or therapeutic use.
Abstract
Faculty: Faculty of Biological and Environmental Sciences
Degree programme: Genetics and Molecular Biosciences
Study track: Molecular and Analytical Health Biosciences
Author: Annie Stendahl
Title: Measurement repeatability of flow cytometry and nanoparticle tracking analysis for optimization of extracellular vesicle measurements
Level: Master’s thesis
Month and year: 11/2022
Number of pages: 92
Keywords: extracellular vesicles, repeatability measurements, metrology, traceability, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, reference material, METVES
Supervisor or supervisors: Virpi Korpelainen, Katariina Maaninka and Pia Siljander
Collaborative partner: VTT Technical Research Centre of Finland Ltd.
Where deposited: E-thesis
Extracellulära vesikler (EV:r) är vesikler, omringade av ett lipid-dubbelskikt och sekreteras av alla celltyper med varierande innehåll från nukleinsyror till proteiner, kolhydrater, metaboliter och lipider. EV:r anses vara involverade i många av cellens fysiologiska och patologiska funktioner. Eftersom de är tillgängliga i alla kroppsvätskor och möjliggör semi-invasiva biopsier, uppvisar EV:er en möjlighet att användas som biomarkörer i klinisk miljö. Således skulle EV:rnas naturliga egenskaper och dess innehåll kunna utnyttjas inom sjukdomsterapi och -behandling. Dock har varken de utvecklade metoderna eller referensmaterialen för fastställande av EV kvantifiering och karakterisering uppnått metrologisk nivå för repeterbarhet och spårbarhet, vilket är nödvändigt för att kunna utnyttja EV:r i klinisk miljö.
Syftet med detta forskningsprojekt var att utvärdera repeterbarheten av de metoder som vanligtvis används för kvantifiering och karakterisering av EV:r, flödescytometri (FCM) och nanoparticle tracking analysis (NTA). Repeterbarheten analyserades med hjälp av referensmaterial gjorda av hollow organosilica beads (HOBs) och biologiska EV testprov som utvecklats i det pågående EU metrologi-projektet METVES II. Ett liknande biologiskt EV testprov förbereddes även som en del av avhandlingsprojektet. Repeterbarhetsmätningarna utfördes även med kalibreringspartiklar som rekommenderats av instrumenttillverkarna för vardera FCM och NTA. Repeterbarhetsmätningarna med kalibreringspartiklarna gav repeterbara resultat från FCM och ett av de två NTA instrumenten som testades, men dock gav varken de syntetiska referens partiklarna eller biologiska EV test proven repeterbara resultat för att avgöra metrologisk repeterbarhet. Dock nåddes värdefull uppfattning om vad för instrument funktioner som kan justeras för att skapa repeterbara resultat med FCM och NTA angående EV analys.
Tidigare insikt om både testprovets typ och metoden som används för mätningarna skulle möjliggöra optimering av både mätningen och instrumentfunktionerna. Oberoende om syftet är kvantifiering eller storlekskarakterisering av EV:r, skulle fel och partiskhet orsakats av instrumentet kunna minimeras genom att justera instrumentinställningar beroende på testprovets typ. Dessutom skulle kvantifiering och storleks karakterisering gynnas av att kombinera olika metoder för att försäkra om mer pålitliga och repeterbara resultat. Det är tydligt att mer forskning måste göras, så som att de testade referensmaterialen kräver vidare utveckling för att kunna etableras som EV referensmaterial och därmed möjliggöra standardisering för EV mätningar. Standardisering av EV kvantifiering och storleks karakterisering är nödvändigt för att uppnå metrologisk repeterbarhelt och i sista hand, spårbarhet, och således kunde EV:r utnyttjas i klinisk miljö som biomarkörer eller inom terapi.
|
| Keyword(s): | extracellular vesicles repeatability measurements metrology traceability flow cytometry nanoparticle tracking analysis reference material METVES |
Files in this item
| Files | Size | Format | View |
|---|---|---|---|
| THESIS_ABSTRACT.pdf | 1.924Mb |